domingo, 29 de setembro de 2013

Una nueva estrategia de captura de ligantes para tratar la acondroplasia


Traducción: Google Translator, con revisión del Autor

Introducción

Un estudio muy interesante que describe una nueva estrategia terapéutica para la acondroplasia se ha publicado el 18 de septiembre . El estudio realizado por el grupo francés liderado por la Dra. Elvire Gouze (1) representa un nuevo enfoque y lo estaremos revisando brevemente aquí.

Sin embargo, con el fin de dejar a entender cómo funciona esta nueva terapia potencial, creo que se merece la pena dar un corto paseo por el mecanismo que causa la acondroplasia. Hay otros artículos en este blog que revisan el tema, pero yo siempre trato de introducir nuevos datos o información, por lo que seguimos aumentando nuestro conocimiento.

Un poco sobre el mecanismo molecular de la acondroplasia

La acondroplasia es causada por un solo cambio (mutación) en la secuencia de gen FGFR3, que genera la proteína que todos conocemos como receptor de factor de crecimiento de fibroblastos del tipo 3 (FGFR3).

El FGFR3 es lo que llamamos una tirosina quinasa receptora (una enzima). Se llama receptor, ya que se coloca a través de la membrana celular de los condrocitos a la "espera" del estímulo apropiado procedente de fuera de la célula (Figura 1). En otras palabras, como un receptor, el FGFR3 "recibe" señales desde el cuerpo, como una antena, y lleva a cabo estas señales al interior de la célula.

Los receptores son bastante específicos y sólo responden a ciertos transmisores. En el caso del FGFR3, sólo algunas moléculas llamadas factores de crecimiento de fibroblastos (FGF) serán capaces de encender la antena. De hecho, trabajos previos han encontrado que el FGFR3 tiene algunos clientes "preferenciales" (los investigadores llaman ligantes). A partir de una familia de 23 FGFs, parece que el FGF9 (2) y el FGF18 (3) son los principales ligantes de activación de la antena FGFR3.

Figura 1. El FGFR3 está situado a través de la membrana celular listo para recibir señales de los FGFs.


La activación del FGFR3 se inicia cuando dos FGFs se unen a dos receptores. Con la ayuda de una molécula cercana similar a la heparina, llamada HSPG (heparan sulphate proteoglicans), el complejo formado por los dos FGFR3s y los dos FGFs, llamado de dímero (Figura 2), producirá un reordenamiento de la sección interior de los dos receptores, que conducirán a la transferencia de algunos iones de fósforo (estoy simplificando), con la posterior transferencia de energía. Este es el comienzo de lo que llamamos la cascada o vía de señalización (Figura 3). Una tras otra, otras proteínas vecinas serán atraídas y dirigirán aún más la señal química a otras hasta que la señal es conducida al núcleo celular. (4)

Figura 2. El dimmer FGF - FGFR (desde el sitio web de Dr. Moosa Mohammadi Lab).

http://www.med.nyu.edu/mohammadi/LabPage/mv2.html
En condiciones normales, el dímero no durará mucho tiempo. Hay sistemas de detección de moléculas activadas que las conducen para su reciclaje o desintegración. Trabajan como sistemas de control para mantener las reacciones químicas celulares en equilibrio.

Figura 3. FGFR3 cascada de señalización.





FGFR3 y la acondroplasia

FGFRs son proteínas clave en el desarrollo del bebé en el útero. Después del nacimiento sin embargo, aunque el FGFR3 está producido por varios tipos de células en el cuerpo, parece que el papel principal de este receptor es en la regulación del crecimiento de los huesos. Básicamente, el FGFR3 es producido por los condrocitos situados en regiones muy especiales que se encuentran en las extremidades de los huesos largos y en los otros huesos del cuerpo, también, que se denominan placas de crecimiento.

En condiciones normales, actuando conjuntamente con otras proteínas y agentes, el FGFR3 controla cómo los condrocitos proliferan, maduran y dan espacio para la formación del nuevo hueso. En este complejo concierto el FGFR3 es un freno natural, reduciendo la capacidad de los condrocitos para multiplicar y madurar.

Sin embargo, en la acondroplasia, la distintiva mutación G380R del FGFR3 hace el dímero más estable, activo durante períodos más largos. Esto es suficiente para "sobrecargar " el núcleo de la célula con señales que "dicen": pare, no se multiplique. Esta excesiva señalización es la causa de la detención del crecimiento óseo que vemos en la acondroplasia.

Parar el receptor workaholic

Desde que el blog ha comenzado hemos revisado una gran cantidad de posibles estrategias para vencer el FGFR3 super activo. Usted puede encontrar más información sobre ellos siguiendo los enlaces que aparecen en la parte superior de esta página, de acuerdo a su idioma preferente. Así, un gran número de posibles tratamientos están sobre la mesa, a espera de inversión. El estudio realizado por García et al. es sólo la más reciente publicado. Vamos a repasar los puntos clave de este estudio.

LA captura de factores de crecimiento de fibroblastos (FGF)

El concepto presentado por el Dr. Gouse y su grupo es que si hacemos una forma libre de FGFR3 disponible para unirse con sus ligantes entonces menos de estos ligantes se acoplan al FGFR3 fijo (el FGFR3 situado a través de la membrana) para generar la cascada de señalización. Por el contrario, desde que el FGFR3 libre no está conectado a las otras proteínas intracelulares que responden a su activación, la señal no se transmite en absoluto. Si no se transmite la señal entonces los efectos negativos del FGFR3 en la placa de crecimiento en los condrocitos cese y las células pueden multiplicarse libremente, restaurando el ritmo de crecimiento.

Hablamos de una estrategia similar hace unos meses en este artículo, en la cual los investigadores crearon una molécula que forma parte del FGFR1 y parte de un anticuerpo, llamada GSK3052230 (antigua FP- 1039), que estudiaron en varios modelos de cáncer en los quales los FGFRs son agentes importantes. Este compuesto fue capaz de evitar que la célula cancerosa se beneficiarse de la activación de FGFR. (5) Es importante destacar que los estudios con este compuesto han encontrado que los ligantes que muestrearon mayor susceptibilidad eran exactamente el FGF9 y el FGF18.

En el estudio de García y sus colegas trabajaron con una copia soluble del FGFR3 humano (sFGFR3), que se inyectó dos veces a la semana en los animales jóvenes en crecimiento, con la misma mutación G380R en FGFR3, teniendo así los patrones de acondroplasia similares (como los huesos largos cortos, cráneo redondeado, estenosis espinal, etc).

Se observaron respuestas en huelga en todos los parámetros medidos. La duración del tratamiento fue de tres semanas, y ratones expuestos a sFGFR3 parecían tener una aparente recuperación total de crecimiento (al menos en la dosis más alta probada) (Figura 4).

Figura 4. Ratones FGFR3 G380R+ tratados y no tratados
 
Desde el artículo de Mitch Leslie, en Science Now
 Examinaron las placas de crecimiento de los animales control (tipo salvaje) y los afectados tratados y no tratados. Ellos encontraron que en los animales afectados tratados hubo una marcada recuperación de la arquitectura normal de la placa de crecimiento. Incluso en los animales de control, hubo un crecimiento adicional en comparación con los animales de control no tratados.

También buscaron evidencia de que el sFGFR3 llega a las placas de crecimiento (recordemos que se cree que las placas de crecimiento son una barrera difícil para las grandes moléculas) y fueron capaces de detectar el sFGFR3 dentro de la placa de crecimiento.

También verificaron si los ligantes esperados (FGF9 y FGF18) se unen a el sFGFR3 y confirmaron que estos ligantes fueron atrapados por el compuesto experimental. Por otra parte, han confirmado además el tipo de efecto ejercido por sFGFR3 que muestra que la cascada clásica del FGFR3, cree que es el responsable de sus efectos en los condrocitos, se inhibió cuando las células de la prueba se expusieron a el sFGFR3 y aquellos ligantes preferenciales.

Por último, los investigadores también examinaron varios órganos y tejidos de los animales sometidos a pruebas y no encontraron signos de toxicidad.

Preguntas

Los resultados son convincentes, la presentación de un compuesto que parece ser, al mismo tiempo eficaz y seguro. Es razonable decir que los investigadores fueron capaces de hacer una prueba de concepto que el compuesto funciona. Sin embargo, no pudimos evitar notar algunos aspectos.

Los expertos evaluaron dos dosis diferentes en los animales (0,25 mg y 2,5 mg). Al revisar las imágenes de los animales en la versión impresa completa del estudio, podemos ver que los animales tratados con la dosis más baja no lograron el mismo tamaño de los animales control. Por el otro lado, el animal afectado tratado con la dosis más grande creció más que el control no tratado (Figura 2 en el artículo completo). Por otra parte, este último animal presenta una columna vertebral más transparente que el control de los animales tratados, de una manera que me recordó el patrón observado en los animales del grupo con exposición continua al CNP en los estudios de Yasoda y colegas. (6)

Para respetar los derechos de autor de las imágenes - sólo publico imágenes aquí que ya están disponibles en la web, siempre citando la fuente - no puedo poner la imagen del ratón japonés aquí, pero los invito a abrir la referencia 6 y a mirar la imagen proporcionada en el artículo. Luego compare los animales tratados (se puede comparar con el animal B en la figura 4). Es posible que, dependiendo de la dosis utilizada, la terapia con sFGFR3 podría dar lugar a un crecimiento excesivo en los animales afectados, de la misma manera que la carga continua de CNP parece hacer, al menos en ratones.

Aunque los investigadores han mostrado alguna evidencia de que el sFGFR3 trabaja atrapando el FGF9 y el FGF18, esto debe investigarse más a fondo. Dado que la interacción entre el FGF, FGFR3 y el HSPG demanda que deben estar todos en la misma zona, es importante entender el mecanismo exacto por el cual el sFGFR3 está trabajando. Cuando hubo la divulgación de las primeras pruebas con el GSK3052230/FP-1039, Dr. Musa Mohammadi, un experto en el campo de las interacciones moleculares FGF-FGFR, mencionó que la captura de ligantes podría no ser el mecanismo de acción de ese compuesto, pero que él podría estar compitiendo con el receptor natural por los HSPGs. (7) Lo mismo podría estar ocurriendo con el sFGFR3. Sin embargo, esta duda no saca el mérito de este compuesto.

Y, a pensar fuera de la caja, este estudio también da más pruebas de que parece que los estudios anteriores concluyendo que la placa de crecimiento sería una enorme barrera para las moléculas más grandes podrían haber pasado por alto algunos aspectos de la biología de esta estructura. Hemos revisado este tema en este artículo anterior, pero ha habido más pruebas recientemente publicadas que muestran que las moléculas más grandes pueden llegar a los condrocitos dentro de la placa de crecimiento (8; revisado aquí). Buena oportunidad para empezar a revisar estos conceptos.

Conclusión

Creo que los investigadores presentan una potencial y atractiva opción terapéutica para el tratamiento de la acondroplasia. Todavía, aún existe la necesidad de aprender que es la dosis correcta para ser probada, cómo va a afectar a los animales más grandes y cómo el cuerpo se ocupa de ella (cómo se metaboliza y se elimina sFGFR3 ), junto con la realización de pruebas de seguridad adecuadas antes de pensar en las pruebas en seres humanos . Para algunas de estas pruebas es necesario el interés de empresas de biotecnología y/o industrias farmacéuticas. En este aspecto, el otro compuesto usando el concepto de trampa de ligante, el GSK3052230/FP-1039, tiene una ventaja: ya está en la fase 1. (9)

Usted puede disfrutar de la lectura del artículo publicado por Science Now, escrito por Mitch Leslie, que es la fuente de la figura 4 de este artículo y que proporciona una buena cobertura de la investigación con el sFGFR3, incluyendo la opinión de investigadores clave en el campo, tales como el Dr. William Horton.

Por último, un padre diligente de un niño con acondroplasia (autor de el blog Beyond Achondroplasia) encontró otro proyecto relacionado con una forma distinta de FGFR3 soluble, éste se desarrolla en EE.UU., financiado por el NIH. Puede encontrar más información aquí. (10). Sin resultados se han publicado todavía, pero el investigador describe que las pruebas ya realizadas también restauraron el crecimiento del hueso en el modelo animal.

Referencias

1. Garcia S et al. Postnatal soluble FGFR3 therapy rescues achondroplasia symptoms and restores bone growth in mice. Sci Transl Med 2013;5:203ra124.
2. Garofalo S et al.Skeletal dysplasia and defective chondrocyte differentiation by targeted overexpression of fibroblast growth factor 9 in transgenic mice. J Bone Miner Res 1999; 14 (11): 1909-15. Libre.

3. Davidson D et al. Fibroblast growth factor (FGF) 18 signals through FGF Receptor 3 to promote chondrogenesis. J Biol Chem 2005; 280: 20509-15. Libre. 
4. Horton W. Molecular pathogenesis of achondroplasia. GGH 2006; 22 (4): 49-54. Libre.

5. Harding TC et al. Blockade of Nonhormonal Fibroblast Growth Factors by FP-1039 Inhibits Growth of Multiple Types of Cancer. Sci Transl Med 2013;5:178ra39.

6. Yasoda A and Nakao K. Translational research of C-type natriuretic peptide (CNP) into skeletal dysplasias. Endocrine J 2010; 57 (8): 659- 66. Libre.

7. News and analysis. Deal watch: HGS and FivePrime in FGF 'ligand trap' deal. Nat Rev Drug Discov 2011;10(5):328. 

8. Ono K et al. The Ras-GTPase activity of neurofibromin restrains ERK-dependent FGFR signaling during endochondral bone formation. Hum Mol Genet 2013; 22(15): 3048–62. doi: 10.1093/hmg/ddt162.
 
9. Tolcher A et al. Preliminary results of a dose escalation study of the fibroblast growth factor(FGF) “trap” FP-1039 (FGFR1:Fc) in patients with advanced malignancies. 22nd EORTC-NCI-ACR symposium on molecular targets and cancer therapeutics, November 16-19, 2010. Berlin, Germany. Libre.

10. Ghivizzani SC. Delivery of soluble FGFR3 as a treatment for achondroplasia. National Institute of Arthritis and Musculoskeletal and Skin Diseases. 2013; Project Number: 5R01AR057422-04.

domingo, 22 de setembro de 2013

Re-utilización de viejos remedios: ¿hay oportunidad para la acondroplasia?



Traducción: Google Translator, con revisión del Autor.

Remedios antiguos, nuevos usos

Con el aumento exponencial en el descubrimiento de la base molecular de las enfermedades, un sorprendente número de nuevos compuestos para los agentes que las causan se han diseñado y/o creado en las últimas décadas. Sin embargo, de miles de moléculas probadas sólo una pequeña fracción de ellas suelen llegar a la etapa de desarrollo clínico, muchos años después de que se las identificaron en un laboratorio. Entre estos nuevos compuestos que alcanzan la investigación clínica solo otra pequeña fracción puede probar que funciona y es lo suficientemente segura para ser administrada a pacientes reales. Muchos de estos compuestos no dan resultados convincentes y serán abandonados. Usted puede leer más sobre el descubrimiento y desarrollo de medicamentos en este artículo anterior del blog.

La tasa de fracaso es alta y se la considera una de las razones por las que el coste medio del desarrollo de un solo medicamento se estima ahora en más de USD 1 mil millones. (1) Con este gran desgaste en la industria farmacéutica (altos costos versus baja productividad), se han diseñados nuevos programas para ayudar a aumentar el descubrimiento y desarrollo de fármacos.

Re-utilización

Uno de los programas que tiene recibido cada vez más atención últimamente es la recuperación o la re-utilización de drogas antiguas. (2,3) La estrategia consiste en analizar los datos adquiridos a partir de trabajos con medicamentos antiguos o abandonados para identificar nuevos usos potenciales de estos compuestos en otras indicaciones clínicas que tienen necesidades no satisfechas, como en el caso de las enfermedades raras. Un buen ejemplo de rescate de medicamentos es el AZT, un medicamento desarrollado para tratar el cáncer, sin éxito, se convirtió en el primer fármaco para tratar la infección del HIV. (4)

Varios esfuerzos se están realizando para muchas enfermedades, especialmente aquellas que no tienen tratamientos eficaces disponibles (por ejemplo, la enfermedad de Alzheimer). (5) Con una excepción, la de la menatretenona, (MK-4, discutida aquí), sin embargo, nunca he conocido a un solo trabajo con antiguas drogas que podrían tratar la acondroplasia.

Cuando estaba revisando el programa del 11º Congreso de la Sociedad Internacional de las Displasias Esqueléticas (ISDS, International Skeletal Dysplasias Society) para preparar el artículo anterior del blog sobre las últimas pruebas que se presentaran allí con el BMN-111, he identificado un estudio mirando exactamente a las ventajas de la estrategia de re-utilización. El estudio por Matsushita et al. (6) describe testes realizados en cultivos celulares de condrocitos y explantes óseos, que tenían un receptor del factor de crecimiento de fibroblastos tipo 3 (FGFR3) hiperactivo, con meclizina (o meclozina), un antihistamínico de bajo costo que se utiliza para tratar el mareo y el vértigo. Ellos encontraron que la meclizina inhibió las enzimas en la cascada de señalización del FGFR3, llamadas de external signal-regulated kinase (ERK, quinasa regulada por señal externo, en traducción libre). Habiendo observado resultados positivos, ellos concluyeran el resumen proponiendo el uso de la meclizina para tratar la acondroplasia.

¿Meclizina para la acondroplasia?

El resumen del estudio es prudente al mencionar sólo una atenuación de la señalización de FGFR3. ¿Cómo funciona esta atenuación? Antes de que alguien comienza a pensar que se debe dar meclizina a los niños con acondroplasia, se necesita más información con el fin de permitir un juicio justo sobre el tema. Será bueno saber si los investigadores probaron si alguna otra vía de señalización se ha visto afectada por la inhibición de ERK. La siguiente figura muestra las cascadas pertinentes del FGFR3 en la acondroplasia. La ERK está situado a lo largo de diversas etapas en la cadena de reacciones químicas de FGFR3 y también responde a otras señales originadas por otros receptores.

Figura.


La meclizina pertenece a la familia de piperazinas (en Inglés). En realidad, no es una sorpresa que los fármacos de esta familia podrían tener efectos sobre los receptores de las enzimas de señalización como el FGFR3: la estructura del núcleo de la piperazina se ha explotada para producir otros medicamentos , incluyendo inhibidores de enzimas receptoras activas en el cáncer (por ejemplo, el imatinib).

Sin embargo, se trata de una excelente noticia. Ya hemos hablado del gran desafío para la acondroplasia o cualquier otra enfermedad rara en artículos anteriores del blog. En pocas palabras: el acceso a la terapia.

Piense en esto: los medicamentos para las enfermedades raras suelen ser muy caros, por muchas razones, desde el coste de su desarrollo (como se ha descrito anteriormente en este artículo) para su limitado mercado. De acuerdo con un resumen publicado por Terrapinn - Total Biopharma, el más caro se conoce como Soliris (eculizumab), desarrollado por Alexion. Este es un tipo de anticuerpo desarrollado para el tratamiento de la hemoglobinuria paroxística nocturna, a un costo de 600.000 dólares por persona por año. Recientemente, Reuters también publicó un artículo citando una terapia génica para otra enfermedad rara llamada deficiencia de lipoproteína lipasa que debería costar más de USD$1 millón por paciente. (7)

Por lo tanto, si un medicamento de bajo costo, como la meclizina o la menatetrenona, que ya tienen perfil de seguridad y toxicidad conocido, muestra que ejerce acción contra la excesiva actividad del FGFR3 en la acondroplasia, el reto del acceso sería resuelto: la disponibilidad de tratamiento adecuado para todos aquellos que lo necesitan.

Vamos a esperar a la publicación del estudio completo de Matsushita y sus colegas para conocer mejor el efecto de la meclizina en los condrocitos y también ver si han progresado en sus experimentos, con pruebas de modelos vivos de acondroplasia.

Referencias

1. Paul SM et al. How to improve R&D productivity: the pharmaceutical industry’s grand
challenge. Nat Rev Drug Discov 2010; 9 (3): 203-14.

2. National Centers for Advancing Translational Sciences (NCATS). Rescuing and Repurposing Drugs. Accessed on Sep 7, 2013.

3. Food and Drug Administration. A Valuable Resource for Drug Developers: The Rare Disease Repurposing Database (RDRD). Accessed on Sep 7, 2013.

4. Collins FS. Mining for therapeutic gold. Nature Rev Drug Discov 2011 (10):397.

5. Nalr P. Drug repurposing gets a boost as academic researchers join the search
for novel uses of existing drugs. PNAS 2013; 110 (7): 2430–2. (Free access)

6. Matsushita et al. Meclozine facilitates chondrocyte proliferation and differentiation by attenuating abnormally activated fibroblast growth factor receptor 3 (FGFR3) signaling in achondroplasia. Presented at the 11th International Skeletal Dysplasias Society Meeting, August 28-31, 2013, Bologna, Italy.

7. Hirschler B. Analysis: Entering the age of the $1 million medicine. Reuters, published on Jan 3, 2013. Accessed Sep 7 2013.

sábado, 21 de setembro de 2013

Uma nova estratégia de captura de ligante para tratar a acondroplasia

Introdução

Em 18 de setembro foi publicado um estudo muito interessante que descreve mais uma estratégia terapêutica para a acondroplasia. O estudo realizado pelo grupo francês liderado pela Dra. Elvire Gouze (1) representa uma nova abordagem de tratamento e nós vamos conversar um pouco sobre ela aqui.

No entanto, a fim de facilitar nossa compreensão sobre como funciona essa nova terapia potencial, acho que vale fazer um pequeno passeio pelo mecanismo causador da acondroplasia. Há outros artigos neste blog que reveem esse tema, mas sempre busco introduzir novos detalhes ou informações, de modo que continuamos a aumentar o nosso conhecimento.

Um pouco sobre o mecanismo molecular de acondroplasia

 
A acondroplasia é causada por uma troca única (mutação) na sequência do gene FGFR3, que gera a proteína conhecida como receptor de fator de crescimento de fibroblastos 3  (FGFR3).

O FGFR3 é o que chamamos de tirosina quinase receptora (uma enzima). Ele é chamado de receptor porque está fixado através da membrana celular dos condrócitos, à "espera" dos estímulos apropriados provenientes do exterior da célula (figura 1). Em outras palavras, como um receptor, o FGFR3 "recebe" sinais do corpo, tal qual uma antena, e redireciona esses sinais para o interior da célula.

Os receptores são bastante específicos e apenas respondem a certos transmissores. No caso do FGFR3, apenas algumas moléculas chamadas fatores de crescimento de fibroblastos (FGFs) serão capazes de ligar a antena. De fato, trabalhos anteriores descobriram que o FGFR3 tem alguns clientes "preferenciais" (ou, como chamam os pesquisadores, ligantes). De uma família de 23 FGFs, parece que o FGF9 (2) e o FGF18 (3) são os principais ligantes que ativam a antena FGFR3.

Figura 1. O FGFR3 está localizado através da membrana celular pronto para receber sinais de FGFs.


A ativação do FGFR3 começa quando dois FGF se ligam a dois receptores. Com o auxílio de moléculas semelhantes à heparina, presentes nas proximidades, chamadas HSPG (do inglês heparan sulphate proteoglycans), o complexo formado pelos dois FGFR3s e os dois FGFs, chamado de dímero (Figura 2), produzirá um rearranjo da parte intracelular dos dois receptores, o que leva à transferência de alguns íons de fósforo (estou simplificando), com subsequente transferência de energia. Este é o início do que chamamos de cascata ou via de sinalização (Figura 3). Uma por uma, outras proteínas vizinhas serão atraídas e enviarão o sinal químico para as outras, até que este alcança o núcleo da célula (4).

Figura 2. O dímero FGF- FGFR (do site do Laboratório do Dr Moosa Mohammadi).



Em condições normais, o dímero não dura muito. Existem sistemas de detecção de moléculas ativadas para encaminhá-las para reciclagem ou desintegração. Eles funcionam como sistemas de controle para manter as reações químicas das células em equilíbrio.

Figura 3. A cascata de sinalização do FGFR3.




O FGFR3 e a acondroplasia

Os FGFRs são proteínas fundamentais durante o desenvolvimento do bebê no útero. Após o nascimento, no entanto, embora o FGFR3 continue a ser o produzido por vários tipos de células do corpo, parece que o principal papel deste receptor está na regulação do crescimento ósseo. Basicamente, o FGFR3 é produzido por condrócitos localizados em regiões muito especiais encontradas nas extremidades dos ossos longos e nos outros ossos do corpo, também, conhecidas como placas de crescimento.

Em condições normais, agindo em conjunto com várias outras proteínas e agentes, o FGFR3 controla como os condrócitos proliferam, amadurecem e dão espaço para o novo osso em formação. Neste complexo concerto o FGFR3 é um freio natural, reduzindo a capacidade de multipicar e amadurecer dos condrócitos.

No entanto, na acondroplasia a mutação G380R no FGFR3 faz o dímero ficar mais estável, ativo por períodos mais longos. Isso é suficiente para "sobrecarregar" o núcleo da célula com sinais que dizem: "pare, não se multiplique". Esta sinalização excessiva é a causa da interrupção do crescimento ósseo que observamos na acondroplasia.

Parar o receptor viciado em trabalho (workaholic)

Desde que o blog começou nós já analisamos uma série de estratégias possíveis para vencer o FGFR3 superativo. Você pode encontrar mais informações sobre elas seguindo os links fornecidos no topo desta página, de acordo com o seu idioma preferido. Podemos dizer que há um grande número de potenciais tratamentos à disposição, aguardando investimento. O estudo realizado por Garcia et al. é apenas a mais recente publicado. Vamos rever os pontos principais deste estudo.

Capturando fatores de crescimento de fibroblastos (FGF)

O conceito trazido pela Dr. Gouse e seu grupo é que se criamos uma forma livre do FGFR3 disponível para conectar com seus ligantes, menos desses ligantes conseguiriam ligar-se ao FGFR3 fixo (o FGFR3 localizado na membrana do condrócito) para gerar a cascata de sinalização do FGFR3. Pelo contrário, uma vez que o FGFR3 livre não está ligado a outras proteínas intracelulares que respondem a sua ativação, o sinal não é transmitido. Se o sinal não é transmitido, então os efeitos negativos do FGFR3 sobre o crescimento dos condrócitos da placa cessam e as células podem se multiplicar livremente, restaurando o ritmo de crescimento.

Conversamos sobre uma estratégia similar há alguns meses neste artigo, em que os pesquisadores criaram uma molécula que é formada por em parte pelo FGFR1 e e pela estrutura básica de um anticorpo, o GSK3052230 (também conhecido como FP -1039), que tem sido explorada em vários modelos de câncer nos quais os FGFRs são agentes importantes. Este composto foi capaz de impedir que as células cancerosas pudessem se aproveitar da ativação de FGFRs. ( 5)
É relevante saber que os estudos com este composto mostraram que os ligantes com maior suscetibilidade foram exatamente o FGF9 e o FGF18.

No estudo realizado por Garcia e colaboradores, eles trabalharam com uma cópia solúvel do FGFR3 humano (sFGFR3), injetada duas vezes por semana em animais jovens em crescimento portadores da mesma mutação G380R no FGFR3, tendo assim padrões acondroplásicos semelhantes (como ossos longos curtos, crânio arredondado, estenose espinhal etc.).

Eles observaram respostas marcantes em todos os parâmetros medidos. A duração do tratamento foi de três semanas, e os animais expostos ao sFGFR3 pareciam apresentar uma recuperação completa do crescimento (pelo menos nos que foram tratados com a maior dose testada) (Figura 4).

 

Figura 4. Ratos portadores do FGFR3 G380R + tratados e não tratados.


do artigo de Mitch Leslie, da Science Now
Eles examinaram as placas de crescimento dos animais controle (normais) e dos afetados não tratados e tratados. Descobriram que, nos animais afetados tratados houve uma recuperação significativa da arquitetura normal da placa de crescimento. Mesmo nos animais do grupo controle, houve um crescimento adicional em relação aos animais controle não tratados.

Eles também procuraram evidências de que o sFGFR3 alcança a placa de crescimento (lembre-se que as placas de crescimento são tidas como uma barreira difícil para grandes moléculas) e foram capazes de detectar o sFGFR3 dentro da placa de crescimento.

Eles também verificaram se os ligantes esperados (FGF9 e FGF18 ) realmente se ligavam ao sFGFR3 e confirmaram que estes ligantes foram capturados pelo composto experimental. Além disso, eles também confirmaram o tipo de efeito exercido por sFGFR3 mostrando que a cascata clássica do FGFR3 que se considera ser a responsável pelos seus efeitos nos condrócitos foi inibida quando as células testadas foram expostas ao sFGFR3 e aos seus ligantes preferenciais.

 

Finalmente, os pesquisadores também examinaram vários órgãos e tecidos dos animais testados e não encontraram sinais de toxicidade.

Perguntas
 
Os resultados do estudo são atraentes, apresentando um composto que parece ser eficaz e seguro ao mesmo tempo. É razoável dizer que os pesquisadores foram bem sucedidos no estabelecimento da prova de conceito (proof of concept) de que seu composto funciona. No entanto, não poderíamos deixar de notar alguns aspectos.

Eles testaram duas doses diferentes em seus animais (0.25mg/kg e 2.5mg/kg). Quando verificamos as imagens dos animais presentes no corpo do artigo, podemos ver que os animais tratados com a dose menor não atingiram o mesmo tamanho do animal controle. Por outro lado, o animal afetado tratado com a dose maior cresceu mais do que o controle não tratado (Figura 2 no artigo completo). Além disso, o animal afetado tratado apresentou uma espinha mais translúcida do que o animal controle tratado, em um padrão que me lembrou o observado nos animais testados o CNP contínuo dos trabalhos de Yasoda e colaboradores. (6)

Para respeitar os direitos autorais de imagens - Eu só posto imagens aqui que já estão disponíveis na web, e sempre citando a fonte - não posso postar a fotografia do rato japonês aqui, mas convido você a abrir a referência 6 e conferir a imagem fornecida no artigo. Em seguida, compare os dois animais tratados no estudo de Garcia e colaboradores (o animal B da figura 4 serve para comparar). É possível que, dependendo da dose utilizada, o tratamento com o sFGFR3 poderia levar ao crescimento excessivo de animais afetados, da mesma maneira que a carga contínua de CNP parece fazer, pelo menos nos modelos testados.

Embora os pesquisadores tenham demonstrado evidências de que o sFGFR3 funciona como armadilha para o FGF9 e o FGF18, isso ainda precisa ser melhor investigado. Uma vez que a interação entre o FGF, o FGFR3 e o HSPG necessita que todos estejam na mesma área, é importante entender o mecanismo exato como o sFGFR3 está funcionando. Quando os primeiros testes com o GSK3052230/FP-1039 foram divulgados, o Dr Moosa Mohammadi, um especialista no campo das interações moleculares entre FGFs e FGFRs, mencionou que a captura de ligantes poderia não ser a razão do modo de ação desse composto, mas que ele poderia estar competindo com o receptor natural pela interação com os HSPG. (7) o mesmo pode estar acontecendo com sFGFR3. No entanto, essa dúvida não tira o mérito deste composto.

E, pensando um pouco mais além, o estudo de Garcia e colaboradores também fornece mais provas de que parece que os estudos anteriores que concluíram que a placa de crescimento seria uma barreira intransponível para moléculas grandes podem ter se perdido em alguns aspectos da biologia desta estrutura. Analisamos este tema neste artigo anterior do blog, mas há outras evidências recentemente publicadas que mostram que moléculas maiores podem atingir os condrócitos no interior da placa de crescimento (8; comentado aqui). Boa oportunidade para começar a rever esses conceitos.
 

Conclusão

Creio que os pesquisadores apresentaram uma interessante potencial opção terapêutica para tratar a acondroplasia. Há ainda a necessidade de descobri qual é a dose certa para ser testada, como a droga afetará animais maiores e como o corpo lida com ela (como o sFGFR3 é metabolizado e eliminado), juntamente com a realização de testes adequados de segurança antes de se pensar em testes em seres humanos. Alguns destes testes precisam ter o interesse de empresas de biotecnologia ou indústrias farmacêuticas para serem realizados. Neste aspecto, o outro composto que utiliza o conceito de captura de ligantes, o GSK3052230/FP-1039, tem uma bela vantagem: já está em fase 1. ( 9)

Você pode se interessar em ler o artigo publicado pela Science Now, de autoria de Mitch Leslie (em inglês), que é a fonte da figura 4 deste artigo, e que proporciona uma boa cobertura da pesquisa com o sFGFR3, incluindo a opinião de pesquisadores importantes no campo, tais como o Dr. William Horton.


Para concluir, uma diligente mãe de uma criança com acondroplasia (autora do blog Beyond Achondroplasia) encontrou outro projeto que explora uma forma distinta de FGFR3 solúvel, este em desenvolvimento nos EUA, financiado pelo NIH. Você pode encontrar mais informações aqui (em inglês). (10) Não há resultados publicados ainda, mas o investigador descreve que os testes já realizados também mostraram restauração do crescimento ósseo no modelo animal.

Referências 


1. Garcia S et al. Postnatal soluble FGFR3 therapy rescues achondroplasia symptoms and restores bone growth in mice. Sci Transl Med 2013;5:203ra124. 

2. Garofalo S et al.Skeletal dysplasia and defective chondrocyte differentiation by targeted overexpression of fibroblast growth factor 9 in transgenic mice. J Bone Miner Res 1999; 14 (11): 1909-15. Acesso livre (em inglês).

3. Davidson D et al. Fibroblast growth factor (FGF) 18 signals through FGF Receptor 3 to promote chondrogenesis. J Biol Chem 2005; 280: 20509-15. Acesso livre (em inglês).

4. Horton W. Molecular pathogenesis of achondroplasia. GGH 2006; 22 (4): 49-54. Acesso livre (em inglês).

5. Harding TC et al. Blockade of Nonhormonal Fibroblast Growth Factors by FP-1039 Inhibits Growth of Multiple Types of Cancer. Sci Transl Med 2013;5:178ra39.
 
6. Yasoda A and Nakao K. Translational research of C-type natriuretic peptide (CNP) into skeletal dysplasias. Endocrine J 2010; 57 (8): 659- 66. Acesso livre (em inglês).

7. News and analysis. Deal watch: HGS and FivePrime in FGF 'ligand trap' deal. Nat Rev Drug Discov 2011;10(5):328. 
 
8. Ono K et al. The Ras-GTPase activity of neurofibromin restrains ERK-dependent FGFR signaling during endochondral bone formation. Hum Mol Genet 2013; 22(15): 3048–62. doi: 10.1093/hmg/ddt162. 

9. Tolcher A et al. Preliminary results of a dose escalation study of the fibroblast growth factor(FGF) “trap” FP-1039 (FGFR1:Fc) in patients with advanced malignancies. 22nd EORTC-NCI-ACR symposium on molecular targets and cancer therapeutics, November 16-19, 2010. Berlin, Germany.
Acesso livre (em inglês).


10. Ghivizzani SC. Delivery of soluble FGFR3 as a treatment for achondroplasia. National Institute of Arthritis and Musculoskeletal and Skin Diseases. 2013; Project Number: 5R01AR057422-04.

sexta-feira, 20 de setembro de 2013

A new ligand trap strategy to treat achondroplasia

Introduction

A very interesting study describing a new therapeutic strategy for achondroplasia has been published on Sep 18th. The study by the French group leaded by Dr. Elvire Gouze (1) represents a new approach and we will be briefly reviewing it here. 

Nevertheless, in order to let us understand how this new potential therapy works, I think it will worth to take a short ride through the mechanism causing achondroplasia. There are other articles in this blog reviewing the subject, but I always try to introduce new details or information, so we keep increasing our knowledge.

A bit about the molecular mechanism of achondroplasia

Achondroplasia is caused by a single switch (mutation) in the FGFR3 gene sequence, which generates the protein we all know as fibroblast growth factor receptor 3 (FGFR3). 

FGFR3 is what we call a receptor tyrosine kinase (an enzyme). It is called receptor because it is placed across the cell membrane of the chondrocyte to "wait" for the appropriate stimulus coming from outside the cell (Figure 1). In other words, as a receptor, FGFR3 "receives" signals from the body, like an antenna, and conducts these signals to the interior of the cell. 

Receptors are quite specific and will only respond to certain transmitters. In the case of FGFR3, only some molecules called fibroblast growth factors (FGFs) will be able to turn on the antenna. Indeed, previous works have found that FGFR3 has some "preferential" clients (or, as researchers call, ligands). From a family of 23 FGFs, it seems that FGF9 (2) and FGF18 (3) are the main ligands activating the FGFR3 antenna.

 Figure 1. FGFR3 is located across the cell membrane ready to receive signals from FGFs.




FGFR3 activation starts when two FGFs bind to two receptors. With the aid of a nearby molecule similar to heparin, called HSPG (from Heparan Sulphate Proteoglycan), the complex formed by the two FGFR3s and the two FGFs, called a dimer (Figure 2), will produce a rearrangement of the interior section of the two receptors, leading to the transfer of some phosphorus ions (I am simplifying), with the subsequent transfer of energy. This is the beginning of what we call signaling cascade or pathway (Figure 3). One after another, other neighbour proteins will be attracted and further direct the chemical signal to others till the signal is driven to the cell nucleus.(4)

Figure 2. The FGF-FGFR dimmer (from the Dr Moosa Mohammadi Lab website).

http://www.med.nyu.edu/mohammadi/LabPage/mv2.html

In normal conditions, the dimer will not last long. There are janitor systems detecting activated molecules to drive them for recycling or disintegration. They work as control systems to keep the cell chemical reactions in balance.

Figure 3. FGFR3 signaling cascade.



FGFR3 and achondroplasia

FGFRs are key proteins during the development of the new baby in utero. After birth however, although FGFR3 keeps being produced by several kinds of cells in the body, it looks like that the main role of this receptor is in the regulation of bone growth. Basically, FGFR3 is produced by chondrocytes located in very special regions found in the extremities of the long bones and in the other bones of the body, too, which are called growth plates

In normal conditions, acting together with several other proteins and agents, FGFR3 controls how chondrocytes proliferate, mature and give space for the new forming bone. In this complex concert FGFR3 is a natural brake, reducing the ability of chondrocytes to multiply and get old (mature).

However, in achondroplasia, the hallmark FGFR3 mutation G380R makes the dimer more stable, active for longer periods. This is enough to "overload" the cell nucleus with signals "saying": stop, do not multiply. This excessive signaling is the cause of the bone growth arrest we see in achondroplasia.

Stopping the workaholic receptor 

Since the blog started we have reviewed a lot of potential strategies to beat the super active FGFR3. You can find more information about them following the links provided on the top of this page, according to your preferential language. So, a large number of potential treatments are on the table, just waiting for investment. The study by Garcia et al. is just the newest published one. Let's review the key points of this study.

Trapping fibroblast growth factors (FGFs)

The concept brought by Dr Gouse and her group is that if we make a free form of FGFR3 available for binding with its ligands then less of these ligands would be binding the fixed FGFR3 (the FGFR3 located across the membrane) to generate the FGFR3 signaling cascade. On the contrary, since the free FGFR3 is not connected to the other intracellular proteins that respond to its activation, the signal is not transmitted at all. If the signal is not transmitted then FGFR3's negative effects on growth plate chondrocytes cease and the cells can multiply freely, restoring the growth pace.

We talked about a similar strategy some months ago in this article, in which the investigators created a molecule that is part of the FGFR1 and part an antibody, named GSK3052230 (formerly FP-1039), and explored it in several cancer models where FGFRs are important agents. This compound was able to prevent cancer cells to profit on the activation of FGFRs. (5) Importantly, the studies with this compound found that the ligands showing more susceptibility were exactly FGF9 and FGF18.

In the study by Garcia and colleagues, they worked with a soluble copy of the human FGFR3 (sFGFR3), which they injected twice a week in young growing animals bearing the same G380R mutation in FGFR3, thus having similar achondroplastic patterns such as short long bones, rounded cranium, spinal stenosis, etc.). 

They observed striking responses in all parameters measured. The treatment duration was three weeks, and mice exposed to sFGFR3 seemed to have apparent full recovery of growth (at least in the largest dose tested) (Figure 4). 

Figure 4. Treated and untreated FGFR3 G380R+ mice.

They examined the growth plates of untreated and treated control (wild type) and affected animals. They found that in the treated affected animals there was a marked recovery of the normal architecture of the growth plate. Even in the control animals, there was additional growth compared to the untreated control animals.

They also searched for evidence of sFGFR3 reaching the growth plates (remember that growth plates are thought to be a hard barrier for large molecules) and were able to detect sFGFR3 inside the growth plate.

They also verified if the expected ligands (FGF9 and FGF18) would bind to sFGFR3 and confirmed these ligands were trapped by the experimental compound. Furthermore, they also confirmed the kind of effect exerted by sFGFR3 showing that the classical FGFR3 cascade thought to be the responsible for its effects in chondrocytes was inhibited when the cells tested were exposed to sFGFR3 and those preferential ligands.

Finally, the researchers also examined several organs and tissues of the tested animals and found no signs of toxicity.

Questions 


The results are compelling, presenting a compound that seems to be at the same time efficient and safe. It is reasonable to say that the researchers were able to make a proof of concept that their compound does work. However, we couldn't help to notice some aspects. 

They tested two different doses in their animals (0.25mg/kg and 2.5mg/kg). When we check the animal pictures provided in the full paper version we can see that the animal treated with the lowest dose didn't achieve the same size of the control animal. By the other side, the affected animal treated with the largest dose grew more than the untreated control (Figure 2 in the full article). Moreover, the latter animal presented a more translucent spine than the treated control animal, in a fashion that reminded me the pattern seen in the animals tested with the continuous CNP exposure in the works by Yasoda and colleagues. (6) 

To respect the copyright of the images - I only post images here that are already available in the web, always citing the source - I can't put the picture of the Japanese mouse here, but I invite you to open the reference 6 and look at the picture provided in the article. Then compare both treated animals (you can compare with the animal B in the figure 4 above). It is possible that, depending on the dose used, sFGFR3 therapy could lead to overgrowth in affected animals, in the same way that continuous CNP loading seems to do, at least in mice.

Although the researchers have showed some evidence that sFGFR3 works by trapping FGF9 and FGF18, this should be further investigated. Since the interaction between FGFs, FGFR3 and HSPG request that they should be all in the same area it is important to understand the exact mechanism by how sFGFR3 is working. When the first tests with GSK3052230/FP-1039 were divulged, Dr Moosa Mohammadi, an expert in the field of FGF-FGFR molecular interactions, mentioned that the ligand trapping could not be the reason for the evidence of action of that compound, but that it would be competing against the natural receptor for the HSPGs.(7) The same could be happening with sFGFR3. Nonetheless, this doubt doesn't take the merit of this compound.

And, thinking out-of-the-box, this study also gives more evidence that it looks like that previous studies concluding that the growth plate would be a massive barrier for larger molecules might have missed some aspects of the biology of this structure. We reviewed this topic in this previous article, but there have been more evidence recently published showing that larger molecules can reach the chondrocytes inside the growth plate (8; reviewed here). Good opportunity to start reviewing these concepts.

Conclusion

I think the researchers presented a compelling potential therapeutic option to treat achondroplasia. There is still the need to learn which is the right dose to be further tested, how it will affect larger animals and how the body deals with it (how sFGFR3 is metabolised and eliminated) along with performing adequate safety tests before thinking in testing in humans. Some of these tests need the interest of biotechs or pharma industries to be accomplished. In this aspect, the other compound using the ligand trap concept, GSK3052230/FP-1039, has an advantage: it is already in phase 1. (9)

You might enjoy reading the article published by Science Now, authored by Mitch Leslie, which is the source of the figure 4 of this article and which provides a good coverage of the research with sFGFR3, including the opinion of key investigators in the field, such as Dr. William Horton.


Finally, a diligent parent of a child with achondroplasia (author of the Beyond Achondroplasia blog) found another project dealing with a distinct form of soluble FGFR3, this one being developed in US, funded by the NIH. You can find more information here.(10) No results have been published yet but the investigator describes that tests already performed also restored bone growth in the animal model.

References 

1. Garcia S et al. Postnatal soluble FGFR3 therapy rescues achondroplasia symptoms and restores bone growth in mice. Sci Transl Med 2013;5:203ra124.

2. Garofalo S et al.Skeletal dysplasia and defective chondrocyte differentiation by targeted overexpression of fibroblast growth factor 9 in transgenic mice. J Bone Miner Res 1999; 14 (11): 1909-15. Free access. 

3. Davidson D et al. Fibroblast growth factor (FGF) 18 signals through FGF Receptor 3 to promote chondrogenesis. J Biol Chem 2005; 280: 20509-15. Free access. 

4. Horton W. Molecular pathogenesis of achondroplasia. GGH 2006; 22 (4): 49-54. Free access.

5. Harding TC et al. Blockade of Nonhormonal Fibroblast Growth Factors by FP-1039 Inhibits Growth of Multiple Types of Cancer. Sci Transl Med 2013;5:178ra39. 

6. Yasoda A and Nakao K. Translational research of C-type natriuretic peptide (CNP) into skeletal dysplasias. Endocrine J 2010; 57 (8): 659- 66. Free access.

7. News and analysis. Deal watch: HGS and FivePrime in FGF 'ligand trap' deal. Nat Rev Drug Discov 2011;10(5):328. 

8. Ono K et al. The Ras-GTPase activity of neurofibromin restrains ERK-dependent FGFR signaling during endochondral bone formation. Hum Mol Genet 2013; 22(15): 3048–62. doi: 10.1093/hmg/ddt162. 

9. Tolcher A et al. Preliminary results of a dose escalation study of the fibroblast growth factor(FGF) “trap” FP-1039 (FGFR1:Fc) in patients with advanced malignancies. 22nd EORTC-NCI-ACR symposium on molecular targets and cancer therapeutics, November 16-19, 2010. Berlin, Germany. Free access.

10. Ghivizzani SC. Delivery of soluble FGFR3 as a treatment for achondroplasia. National Institute of Arthritis and Musculoskeletal and Skin Diseases. 2013; Project Number: 5R01AR057422-04.