terça-feira, 18 de junho de 2013

Interferindo na produção do FGFR3: uma potencial estratégia para tratar a acondroplasia

Em vários artigos anteriores deste blog revimos alguns conceitos, tais como o que é DNA e como proteínas como o receptor de fator de crescimento de fibroblastos do tipo 3 (FGFR3) são produzidas. No entanto, como desta vez o tema é exatamente uma estratégia que visa inibir a expressão (produção) do FGFR3, acho que vale a pena rever o tema novamente.

O leitor deve ter em mente que este texto é como uma vista panorâmica sobre o assunto, com muitos detalhes retirados de propósito, para torná-lo mais fácil de entender. Nós falaremos apenas do FGFR3 e dos condrócitos da placa de crescimento, pois as reações podem ocorrer de forma ligeiramente diferente em outras condições ou tecidos do corpo.

Para alguns dos dezessete leitores que seguem este blog, o texto pode parecer repetitivo, com informações já conhecidas. No entanto, quando o assunto já foi visto antes, tento incluir um mais alguns detalhes, pois assim, juntos, seremos capazes de aumentar o nosso conhecimento. E, finalmente, para este texto preparei um glossário simples localizado antes das referências. As palavras em itálico receberam uma explicação curta e, se o texto parecer difícil de entender, espero que ajude um pouco. Alguns destes termos também têm links para outros sites que contem mais informações sobre eles.

 
Como o FGFR3 é feito


Revimos este processo em uma série de três artigos publicados no início de 2012 e você pode encontrá-los clicando na aba Português no topo da página. Busque os artigos que citam produção de FGFR3 e o mundo do RNA.

 Em resumo

O FGFR3 é uma proteína ativa (uma enzima), uma grande molécula feita de outras menores chamadas aminoácidos. Pense no FGFR3 como uma longa cadeia de blocos de Lego (aminoácidos), cada um tendo cargas elétricas distintas. Quando a estrutura final do bloco é atingida, esta enzima receptora ganhará suas propriedades elétricas funcionais. Fazer uma enzima funcional, no entanto, depende de um longo processo de montagem.

O DNA é uma espécie de cofre onde todas as instruções necessárias para criar proteínas estão guardadas. Quando o condrócito recebe um sinal químico instruindo a célula a produzir mais FGFR3, um processo multi-passo começa por abrir o cofre.

Em primeiro lugar, fatores de transcrição se ligam a determinados trechos do DNA antes do ponto onde o gene FGFR3 está localizado. Quando um fator de transcrição faz isso, outras proteínas nucleares locais são acionadas e formam um complexo que começará a “ler” a sequência do gene (transcrição) para produzir uma cadeia de RNA que espelha o que está escrito no DNA. Esta cadeia de RNA é chamada de pré RNA mensageiro, ou simplesmente pré-mRNA. Você pode assistir a esses vídeos de curta duração (animação 1 e animação 2, ambos em inglês) para ter uma idéia de como a transcrição funciona.


A cadeia de RNA criada no processo de transcrição contém toda a informação existente na sequência de DNA do gene, de modo que possui não só as sequências de nucleotídeos que geram as proteínas (chamadas de éxons), mas também aquelas que são feitas de sequências não codificantes (chamadas de íntrons). Assim, antes do mRNA poder ser lido e traduzido para uma proteína, necessita ser liberado dessas partes que não contem informações úteis.


Após este passo, o mRNA maduro é conduzido para o citoplasma onde será ligado a um outro conjunto de proteínas, dentro dos ribossomos, dando início ao processo chamado de translação, que levará à produção do FGFR3.

Esta animação curta, mas muito interessante da revista Nature vai ajudar você a entender o processo de translação. Preste atenção nos últimos 20 segundos. As pequenas moléculas que se ligam ao mRNA no ribossomo trazem o aminoácido certo, de acordo com a sequência de nucleotídeos do mRNA. Você notou que eles se parecem com garfos de três pontas? Há uma razão para isso. Cada aminoácido é escolhido de acordo com grupos constituídos por três nucleotídeos, conhecidos como códons.

Na acondroplasia, uma alteração de um único nucleotídeo de um desses códons da cadeia do gene FGFR3
(localizado na posição 1138) provoca a mudança de um aminoácido na posição 380 da proteína FGFR3. Isso é suficiente para produzir as características clínicas da acondroplasia. Neste artigo anterior do blog há uma explicação mais detalhada da mutação que provoca a acondroplasia.

No entanto, a transcrição é um processo altamente controlado e alguns passos adicionais ocorrem antes do FGFR3 ser produzido e liberado para exercer suas ações. Um desses passos é realizado por um outro tipo de molécula de RNA, chamado micro-RNA, ou simplesmente miRNA. A ação principal dos miRNAs é de regular a expressão de proteínas e eles fazem isso ligando-se a seqüências específicas do mRNA, interferindo com e assim interrompendo a sua leitura no ribossomo e, consequentemente, a produção da proteína. (1) Supõe-se que a função do miRNA está relacionada com a manutenção do equilíbrio da expressão de proteínas que, em caso contrário, fossem produzidas continuamente, poderiam causar doenças. Existe pelo menos um miRNA já identificado cujo alvo natural é o FGFR3. (2)

Terapias potenciais para acondroplasia


Quando olhamos para as atuais potenciais estratégias de tratamento disponíveis publicamente para a acondroplasia, podemos concluir que todas são dirigidas contra o receptor depois que ele é produzido ou contra as reações químicas ligadas à atividade do FGFR3. Isso inclui os inibidores de tirosina quinase, CNP, PTH / PTHrP, aptâmeros, peptídeos, armadilhas de ligante e anticorpos. Com a possível exceção da hipótese ainda não comprovada de que a MK-4 pode inibir a produção de FGFR3 em condrócitos, nenhuma destas estratégias é dirigida contra a produção do FGFR3.

Mas, e se há alguém buscando isso? Algumas semanas atrás, durante uma pesquisa que realizei enquanto escrevia o artigo anterior do blog, sobre os aptâmeros, encontrei um registro de patente que imediatamente chamou minha atenção.

Interferindo com a produção do FGFR3

A empresa americana de biotecnologia chamada Marina Biotech patenteou um grupo de moléculas concebidas para interferir com a produção do FGFR3, através do chamado processo de interferência de RNA. (2) A interferência de RNA é mostrada nesta rica animação produzida pela revista Nature.

Visitar o site da empresa foi um pouco frustrante, já que nada é mencionado em relação a estes compostos, mas a descrição da patente contém informações interessantes sobre os testes já realizados em modelos de câncer relacionados ao FGFR3, nos quais os compostos foram capazes de reduzir o crescimento do câncer.

Infelizmente, a patente, embora cite sete vezes a possibilidade de utilizar este invento como uma terapia para a acondroplasia, não mostra qualquer ensaio realizado em um modelo de acondroplasia. Como nada é divulgado, podemos pensar que isso parece mais um caso de uma terapia potencial à espera de ser explorada por um investigador interessado. O mesmo caso dos peptídeos, armadilhas de ligante e anticorpos que analisamos aqui nos últimos meses.

O uso de RNA de interferência contra o FGFR3 é possível e já foi realizado em alguns trabalhos, como no caso do estudo dos Drs. Guzman, Pintor e Legeai-Mallet. (3)

A boa notícia é que estamos assistindo a um número cada vez maior de opções terapêuticas tornando-se disponíveis para testes. Isso me faz pensar que, nas palavras de um importante  investigador no campo da acondroplasia, é provável que no futuro próximo a questão não será se haverá uma terapia para a acondroplasia mas qual vamos escolher para tratar nossos filhos.


Glossário

  • Aminoácidos: moléculas com várias propriedades químicas diferentes, que são combinadas em sequências variadas para gerar proteínas.




  • Códon: conjuntos de três nucleotídeos que contêm as informações necessárias para identificar o aminoácido certo durante a montagem de proteínas. Uma troca de nucleotídeos na posição 1138 do gene FGFR3 leva à inserção do aminoácido errado na cadeia da proteína FGFR3 e provoca a acondroplasia.



  • Condrócitos: as células dentro das cartilagens de crescimento, os mestres do crescimento ósseo. Na acondroplasia, devido à função excessiva do FGFR3 com a mutação G380R, eles são forçados a reduzir suas taxas de multiplicação e de maturação, o que por sua vez provoca uma perda significativa do crescimento do osso.

  • Éxons e íntrons: éxons são as partes da sequência do gene que contém os códons que serão traduzidos nos aminoácidos para formar proteínas. Os íntrons são as partes do gene que não possuem códons.
(da Wikipedia)


  • Nucleotídeos: são as quatro moléculas básicas que, combinadas em seqüências de três (códons), irão codificar as informações necessárias para a produção das proteínas.
(de http://cs.boisestate.edu/~amit/teaching/342/lab/structure.html)

  • Receptor do fator de crescimento de fibroblastos tipo 3 (FGFR3): uma enzima responsável pelo controle da velocidade de proliferação e maturação de condrócitos, que trabalha como um freio natural. Quando está funcionando exageradamente devido a uma mutação ativadora, provoca redução do crescimento do osso. A acondroplasia, a causa mais comum de nanismo, é consequência de uma mutação ativadora do FGFR3.
  • Transcrição: o processo através do qual um gene é lido e um RNA mensageiro é criado. É o primeiro passo principal para uma proteína ser produzida.

    • Fatores de transcrição: proteínas capazes de identificar certas sequências de nucleotídeos no DNA para dar início a leitura do gene.

  • Translação: este é o processo através do qual uma sequência de nucleotídeos presentes na cadeia do mRNA é traduzida para uma sequência de aminoácidos, criando uma nova proteína.

  • Trechos do DNA antes do ponto de início do código do gene (upstream sites): eles significam sequências de nucleotídeos localizadas antes da sequência do gene. Existem pelo menos duas dessas regiões localizadas antes da sequência de genes, a promotora (promoter) e a potencializadora (enhancer) e elas são muito importantes para permitir a expressão do gene, como faróis para o complexo de proteínas que lerá o gene (ver texto).
Referências

1. Gibson G and Asahara H. microRNAs and cartilage. J Orthop Res. 2013 Jun 10. doi: 10.1002/jor.22397. [Epub ahead of print].


2. Oneyama C et al. MicroRNA-mediated downregulation of mTOR/FGFR3 controls tumor
growth induced by Src-related oncogenic pathways. Oncogene 2011;30:3489–501.
3. Marina Biotech Patent WO 2011139842 A2. Nucleic acid compounds for inhibiting fgfr3 gene expression and uses thereof. 2011.

4. Guzman-Aránguez A, Legeai‐Mallet L, Pintor J. Fibroblast growth factor receptor 3 inhibition by small interfering RNAs in achondroplasia. Anales Real Acad Nac Farm 2011; 77(1).



domingo, 16 de junho de 2013

Interfering in the production of FGFR3: a potential strategy to treat achondroplasia

In several of the previous articles of this blog we have reviewed concepts such as what is DNA and how proteins like the fibroblast growth factor receptor 3 (FGFR3) are produced. However, as this time the topic is exactly a strategy that aims to inhibit the expression (production) of FGFR3, I think it will worth to see it again. 

The reader should keep in mind that the text is like a panoramic view of the subject, with many details being taken off on purpose, to make it easier to understand. We will be talking only about FGFR3 and the growth plate chondrocyte, since things can occur slightly differently in other body tissues or conditions.

For some of the seventeen readers who follow this blog, the text might sound repetitive, with already known information. However, when the subject has already been seen before, I try to include a piece more of detail, so we will together be capable to increase our knowledge. And finally, for this text I prepared a simple glossary located at the end, before the references. Words in italic will have a simple definition there so, if things seem to be hard to understand I hope it would help a bit. Some of these terms will also have hyperlinks to other sites containing more information about them.

 How FGFR3 is made

We have reviewed this process in a series of three articles published in the beginning of 2012 and you can find them by clicking on the English tab on the top of the page. There, look at the articles mentioning FGFR3 production and the RNA world.

In brief

FGFR3 is an active protein (an enzyme), a large molecule made of smaller molecules called amino acids. You can think on FGFR3 as a long chain of Lego blocks (amino acids), each one bearing distinct electrical charges. When the final block disposition is attained, this receptor enzyme will gain its functional electric properties. Making a functional enzyme, however, is a long assembly process.

The DNA is a kind of vault where all the instructions needed to create proteins are saved. When the chondrocyte receives a chemical signal instructing the cell to produce more FGFR3, a multi-step process begins by opening the vault.

First, transcription factors bind a specific site upstream of the DNA region where the FGFR3 gene is located. When a transcription factor does this, other local nuclear proteins are triggered and form a complex that will start to read the gene sequence (transcription) to produce a RNA chain that mirrors what is written in the DNA. This RNA chain is called pre messenger RNA, or simply pre-mRNA. You can watch these short videos (animation 1 and animation 2) to have an idea of how it works.

The RNA chain created in the transcription process contains all the information existent in the gene DNA sequence, so it carries not only those nucleotide sequences that generates the proteins (called exons) but also those that are made of non-coding sequences (called introns). Thus, before the mRNA can be read and translated to a protein, it needs to be cleared of those useless parts.

After this step, the mature mRNA is driven to the cytoplasm where it will be engaged by another set of proteins within the ribosomes, starting the process called translation, which leads to the assembly of the FGFR3 protein. 

This short but very nice animation from Nature will help you to understand the translation process. Pay attention to the last 20 seconds. The small molecules binding to the mRNA in the ribosome will bring the right amino acid according to the nucleotide sequence in the mRNA. Did you notice they look like three sting forks? There is a reason for that. Each amino acid is chosen according to groups comprised of three nucleotides, which are called codons.

In achondroplasia, a change of a single nucleotide (located in the position 1138) in one of those codons of the FGFR3 gene provokes the change of one amino acid in the position 380 of the FGFR3 protein. This is enough to cause the clinical features of achondroplasia. In this previous article of the blog there is a more detailed explanation of the mutation behind achondroplasia.

However, transcription is a strongly controlled process and some additional steps take place before FGFR3 is produced and released to exert its actions. One of these steps is ruled by another kind of RNA molecule, called micro-RNA, or simply miRNA. Micro-RNAs' main action is to regulate the expression of proteins and they do this through binding specific sequences in the mRNA, thus interfering with and interrupting its reading and consequently the protein assembly.(1) It is supposed that miRNA function is related to balance the expression of proteins which, if otherwise were continuously produced, could cause diseases.There is at least one miRNA already identified which has FGFR3 as a natural target.(2)

Potential therapies for achondroplasia

When we look at all the current potential strategies publicly available for achondroplasia, we conclude that all are directed against the receptor after it is assembled or against the chemical cascades linked to FGFR3 activity. This includes tyrosine kinase inhibitors, CNP, PTH/PThrP, aptamers, peptides, ligand traps and antibodies. With the possible exception of the still unproven hypothesis that MK-4 can inhibit the production of FGFR3 in chondrocytes, none of these strategies are directed against FGFR3 production.

But what if there is someone already looking at this? A couple of weeks ago, during a search I performed when I was writing the blog's previous article about aptamers, I found a patent registry which immediately caught my attention. 

Interfering with FGFR3 production

The American biotechnology company called Marina Biotech has patented a group of molecules designed to interfere with FGFR3 production, through the processs called RNA interference. (3) RNA interference is shown in this very nice animation provided by the journal Nature.

Visiting the company's website was a bit frustrating since nothing is mentioned regarding these compounds there, but the patent description contains interesting information about tests already made in FGFR3-related cancer models where the compounds were able to reduce cancer growth.

Unfortunately, the patent, although citing the possibility of using this invention as a therapy for achondroplasia seven times, doesn't show any test made in an achondroplasia model. Since nothing is disclosed, we can think this looks like another case of a potential therapy waiting for an interested investigator to be explored. The same case of the peptides, ligand traps and antibodies we have reviewed here in the last months.

RNA interference against FGFR3 is possible and has already been accomplished in some studies, such as in the one by Drs. Guzman, Pintor and Legeai-Mallet.(4

The good news is that we are witnessing an increasing number of therapeutic options becoming available for testing. It makes me think that, in the words of a top investigator in the field, it is likely that in the near future the question will not be if there will be a therapy for achondroplasia but which one we will choose to treat our children. 

Glossary

Amino acids: molecules with several distinct chemical properties that are combined in multiple sequences to generate proteins.



Codon: sets of three nucleotides that contain the information needed to match the right amino acid during the protein assembly. A nucleotide mismatch in the position 1138 of the FGFR3 gene leads to the placement of the wrong amino acid in the FGFR3 protein chain and causes achondroplasia.
 (from BioGem.Org)

Chondrocytes: the cells within the cartilage growth plates, the masters of bone growth. In achondroplasia, due to the excessive function of the FGFR3 mutation G380R, they are forced to reduce their multiplication and maturation rates, which in turn causes a significant loss of bone growth.

Exons and introns: exons are the parts of the gene sequence containing the codons that will be translated in amino acids to form proteins. Introns are the parts of the gene that do not have codons.




(from Wikipedia)

Fibroblast growth factor receptor 3 (FGFR3): an enzyme responsible for the control of chondrocyte proliferation and maturation speed, working like a natural brake. When it works too much due to an activating mutation, it causes bone growth arrest. Achondroplasia, the most common cause of dwarfism, is caused by an activating mutation of FGFR3.

Nucleotides: they are the four basic molecules which, combined in sequences of three (the codons), will encode the information needed to the production of the proteins.


Transcription: the process through which a gene is read and a messenger RNA is created. It is the first main step for a protein to be produced.

Transcription factors: proteins capable to identify certain nucleotide sequences in the DNA and bind them.

Translation: This is the process through which a sequence of nucleotides present in the mRNA chain is translated into an amino acid sequence, creating a new protein.

Upstream sites: They mean sequences of nucleotides located before the gene sequence. There are at least two of these regions located before the gene sequence, the promoter and the enhancer sequences and they are very important to allow gene expression, like beacons for the protein complex that will read the gene (see text).

References

1. Gibson G and Asahara H. microRNAs and cartilage. J Orthop Res. 2013 Jun 10. doi: 10.1002/jor.22397. [Epub ahead of print].

2. Oneyama C et al. MicroRNA-mediated downregulation of mTOR/FGFR3 controls tumor
growth induced by Src-related oncogenic pathways. Oncogene 2011;30:3489–501.


3. Marina Biotech Patent WO 2011139842 A2. Nucleic acid compounds for inhibiting fgfr3 gene expression and uses thereof.

4. Guzman-Aránguez A, LegeaiMallet L, Pintor J. Fibroblast growth factor receptor 3 inhibition by small interfering RNAs in achondroplasia. Anales Real Acad Nac Farm 2011; 77(1).


terça-feira, 4 de junho de 2013

Explorando el uso de aptámeros para el tratamiento de la acondroplasia

Traducción: Maria Cristina Terceros


Introducción

Hace mucho tiempo se sabe que existe un gran número de proteínas (cadenas de moléculas hechas de aminoácidos) que son capaces de unirse directamente con regiones específicas del DNA (cadenas de moléculas hechas de nucleótidos), ya sea para estimular el inicio de un proceso de lectura de un gen (transcripción) o bloquearlo. De esta manera, debe ser fácilmente imaginable que moléculas hechas de nucleótidos también puedan ser capaces de conectarse directamente a las proteínas.

En los años noventa, con este concepto en mente, los científicos pasaron a identificar un gran número de moléculas hechas de secuencias de nucleótidos de DNA o de RNA, a los cuales dieron el nombre de aptámeros (1,2). No sé si usted ya ha leído el último artículo de este blog. En él, intenté comparar la manera como los investigadores intentan encontrar nuevas drogas con técnicas que se pueden comparar con un tipo de pesca o de filtrado. Para los aptámeros podemos usar el mismo concepto, una vez que tecnología actual usada para identificarlos, conocida por la sigla SELEX, también usa un método de filtrado para seleccionar las mejores moléculas candidatas.

De la misma forma que aquellas proteínas capaces de unirse directa y específicamente a algunas secuencias-objetivo (o diana) de nucleótidos del DNA en el núcleo de la célula, los aptámeros también son bastante específicos con relación a sus objetivos. Podemos seleccionar cualquier parte del objetivo como anzuelo para los aptámeros. En el caso de una enzima receptora, tal como nuestro ya viejo conocido receptor del factor de crecimiento de los fibroblastos tipo 3 (FGFR3), este anzuelo puede ser la parte externa de la enzima, o de un segmento transmembrana o los bolsillos de ATP (figura) de los cuales ya hablamos en artículos anteriores.


Esta propiedad en particular, de contar con un único y específico objetivo, hace de los aptámeros una estrategia potencial para el tratamiento de enfermedades o condiciones donde hay una proteína que no está funcionando correctamente. ¿Consiguen imaginar eso? Vamos a dar el ejemplo de un aptámero que ya está siendo usado en un tratamiento clínico.

Un aptámero en acción

La degeneración macular es una condición que afecta a los ojos de las personas de mayor edad y puede conducir a la ceguera. Uno de los mecanismos que conduce a ese disturbio es un exceso de proliferación vascular (creación de un número excesivo de nuevos vasos sanguíneos en la retina). La producción de nuevos vasos está gestionada por la activación de un receptor en la membrana celular de las células presentes en la retina denominado receptor del factor de crecimiento endotelial vascular (VEGF), y, lógicamente, la molécula que se une a él es un VEGF (también llamado ligante).

Existen varias terapias disponibles para el tratamiento de esta condición, con eficacia variable, pero entre ellas hay una que es singular: el pegaptanib, el primer aptámero a llegar a la farmacia. Vendido como Macugen ™, el pegaptanib es un aptámero específico para el VEGF. Su modo de acción es simple: al unirse, al ligarse al VEGF, él bloquea la capacidad de este ligante de conectarse al receptor (figura). Como el receptor no puede ser activado, la producción de nuevos vasos sanguíneos no es estimulada y la condición no evoluye en el mismo ritmo en que lo haría si fuese dejada sin tratamiento.


Desde el descubrimiento de los aptámeros, muchos han sido desarrollados para varios fines terapéuticos y ahora están siendo explorados en estudios clínicos, en su mayor parte contra el cáncer. El cáncer es verdaderamente un gran desafío y ha sido realizado un esfuerzo enorme con el propósito de encontrar nuevas terapias para derrotarlo. La investigación incluye objetivos tales como el receptor del factor de crecimiento epitelial (EGFR), otra enzima localizada atravesada en la membrana celular de la misma manera que el FGFR3. El funcionamiento excesivo del EGFR es frecuentemente encontrado en el cáncer de mama (y en otros tipos de cáncer también) y, actualmente, algunas de las terapias más eficaces para el cáncer de mama están dirigidas contra el EGFR.

Controlando la cantidad de señales a partir de la antena

Antes de que continuemos con nuestro vuelo sobre los aptámeros, será bueno entender como la célula administra los muchos, muchísimos receptores activos localizados en la membrana celular. Esto será importante para pensar sobre lo que podemos esperar con relación a una de las posibles maneras de cómo un aptámero que apunta hacia el FGFR3 podría funcionar.

Como dije antes, existen centenares de diferentes receptores instalados a través de la membrana celular, todos ellos funcionando como antenas químicas para ayudar a la célula a reaccionar a lo que está sucediendo en su medio. De la defensa inmune a la apoptosis, un número increíble de interacciones celulares guiadas por esas antenas ya fueron descritas.

Sin embargo, estas antenas no son permanentes. Como en cualquier proceso biológico para mantener la vida en equilibrio, existe un cierto número de sistemas de control que regulan el tiempo de acción de esos receptores. Cuando una enzima receptora, vamos a decir el FGFR3, es activada por un ligante (un FGF), forma un complejo molecular que comienza a transmitir señales a sus cascadas químicas específicas (revisada aquí) y, a continuación, es atraída hacia el interior de la célula. Entonces, este complejo es identificado por proteínas tales como la ubiquitina, la cual irá a marcarlo y a conducirlo a los sistemas de degradación, donde las proteínas son deshechas. Al usar estos sistemas de control, la célula es capaz de regular el tiempo que un receptor puede conducir señales desde el exterior hacia el núcleo de la célula. ¿Consigues darte cuenta hacia donde nos estamos dirigiendo?

Aptámeros concebidos para ligarse (unirse) con el EGFR2 (HERB2) hacen con que su degradación sea acelerada y reducen el crecimiento del cáncer.

En un estudio reciente, investigadores identificaron un par de aptámeros específicos para el  EGFR2. El EGFR2 es una de las cuatro enzimas receptoras de la familia EGFR y es un importante factor para algunas formas de cáncer de mama y otros cánceres. El bloqueo o la desactivación del EGFR2 causan reducción del crecimiento del tumor y reducen la tasa de recidiva en casos debidamente tratados. En este estudio, Mahlknecht G et al. (3) realizaron varios tests con aptámeros identificados por ellos, y descubrieron que ellos actuaban forzando la degradación del receptor sin que este hubiese sido activado. Esto, a su vez, dio como resultado la inhibición del crecimiento del tumor en los modelos usados en los tests. Los aptámeros testeados no mostraron mayores problemas en términos de toxicidad, cosa que también es una información importante.

En resumen, este estudio puso en evidencia que un aptámero con un objetivo localizado en el exterior de la célula es capaz de bloquear su función y además causa el efecto previsto (aquí, la inhibición del crecimiento del tumor). La misma estrategia puede ser aplicada para el FGFR.

La estrategia de usar aptámeros para la acondroplasia puede tener sus ventajas:
  • Los aptámeros son pequeñas moléculas probablemente capaces de transitar libremente en la placa de crecimiento y alcanzar, llegar hasta el condrocito;
  • Los aptámeros son muy específicos, haciendo bajo el riesgo de causar efectos fuera – del – objetivo (cuando un medicamento provoca efectos debido a la interacción con un objetivo no – pretendido);
  • Los aptámeros suelen tener un perfil de bajo riesgo en toxicidad.
Sin embargo, los aptámeros son un poco frágiles y víctimas naturales del sistema enzimático del cuerpo. Ellos necesitan protección para llegar a sus objetivos. Esto puede ser conseguido con el acoplamiento de transportadores y disfraces, con uno de los muchos sistemas ya disponibles (analizamos eso aquí). Este obstáculo no es nada que no pueda ser solucionado.

Concluyendo

Al finalizar el año de 2012, en una charla con un especialista en el desarrollo de medicamentos y de inversiones de capitales de riesgo, mencione los aptámeros como una estrategia que podría ser explorada como una potencial terapia para la acondroplasia, pero este especialista se mostro escéptico con relación a ellos. Mi opinión es que no sabemos. Desde que aprendí sobre los aptámeros he realizado búsquedas aleatorias en bancos de datos médicos, como ser el Pubmed y nunca encontré un estudio testeando aptámeros contra el FGFR3. Aquí, el desafío es nuevamente encontrar un investigador con mente abierta y con recursos adecuados, para explorar la posibilidad de que los aptámeros sean utilizados en el tratamiento de la acondroplasia.

 Referencias

1. Tuerk C, Gold L. Systematic evolution of ligands by exponential enrichment: RNA ligands to bacteriophage T4 DNA polymerase. Science 1990; 249 (4968): 505-10. 
2. Ellington AD, Szostak JW. In vitro selection of RNA molecules that bind specific ligands. Nature 1990; 346 (6287):818–22.
3. Mahlknecht G et al. Aptamer to ErbB-2/HER2 enhances degradation of the target and inhibits tumorigenic growth. PNAS 2013; 110 (20): 8170-75.









domingo, 2 de junho de 2013

Explorando o uso de aptâmeros para tratar a acondroplasia

Introdução

Há muito tempo se sabe que há um grande número de proteínas (cadeias de moléculas feitas de aminoácidos) que são capazes de se ligar diretamente com regiões específicas do DNA (cadeias de moléculas feitas de nucleotídeos), quer para estimular o início de um processo de leitura de um gene (transcrição) quer para bloqueá-lo. Assim, deve ser facilmente imaginável que moléculas feitas de nucleotídeos também possam ser capazes de se conectar diretamente à proteínas.

Nos anos noventa, com este conceito em mente, os cientistas passaram a identificar um grande número de moléculas feitas de sequências de nucleotídeos de DNA ou RNA, que chamaram de aptâmeros (1,2). Não sei se você já leu o último artigo deste blog. Nele, tentei comparar a forma como pesquisadores buscam encontrar novas drogas com técnicas que parecem com um tipo de pesca ou de filtragem. Para aptâmeros, podemos usar o mesmo conceito, uma vez que a tecnologia atual usada para identificá-los, conhecida pela sigla SELEX (link em inglês), também usa um método de filtragem para selecionar as melhores moléculas candidatas.

Da mesma forma que aquelas proteínas capazes de se ligar direta e especificamente a algumas sequências-alvo de nucleotídeos do DNA no núcleo da célula, aptâmeros também são muito específicos em relação aos seus alvos. Você pode selecionar qualquer parte do alvo como isca para os aptâmeros. No caso de uma enzima receptora, tal como o nosso familiar receptor de fator de crescimento de fibroblastos do tipo 3 (FGFR3), esta isca pode ser a parte externa da enzima, ou de um segmento transmembrana ou os bolsos de ATP (figura) de que já falamos em artigos anteriores.

 

Esta propriedade particular, de ter um único e específico alvo, faz dos aptâmeros uma potencial estratégia para o tratamento de doenças ou condições em que a causa é uma proteína que não está funcionando corretamente. Você consegue imaginar isso? Vamos dar um exemplo de um aptâmero já em uso na clínica.

Um aptâmero em ação

A degeneração macular é uma condição que afeta os olhos das pessoas de mais idade e pode levar à cegueira. Um dos mecanismos que leva ao distúrbio é um excesso de proliferação vascular (criação de um número excessivo de novos vasos sanguíneos na retina). A produção de novos vasos é gerida pela ativação de um receptor na membrana celular das células presentes na retina chamado de receptor do fator de crescimento endotelial vascular (VEGFR) e, claro, a molécula que se liga a ele é um VEGF (também chamado de ligante).

Existem várias terapias disponíveis para o tratamento desta condição, com eficácia variável, mas uma é singular: o pegaptanib, o primeiro aptâmero a chegar à farmácia. Vendido como Macugen™, o pegaptanib é um aptâmero específico para o VEGF. Seu modo de ação é simples: ao se ligar ao VEGF, ele bloqueia a capacidade deste ligante de se conectar ao receptor (figura). Como o receptor não pode ser ativado, a produção de novos vasos sanguíneos não é estimulada e a condição não evolui no mesmo ritmo que faria se deixada sem tratamento.


Desde a descoberta dos aptâmeros, muitos têm sido desenvolvidos para vários fins terapêuticos e estão agora sendo explorados em estudos clínicos, na sua maior parte contra o câncer. O câncer é realmente um grande desafio e um enorme esforço tem sido feito a fim de encontrar novas terapias para vencê-lo. A pesquisa inclui alvos como os receptores de membrana celular, tais como o receptor do fator de crescimento epitelial (EGFR), uma outra enzima localizada atravessada na membrana celular do mesmo modo que o FGFR3. O funcionamento excessivo do EGFR é frequentemente encontrado no câncer de mama (e em outros tipos também) e, hoje, algumas das terapias mais eficazes para o câncer de mama são dirigidas contra o EGFR.

Controlando a quantidade de sinais a partir da antena

Antes de continuarmos o nosso voo sobre os aptâmeros, será bom entender como a célula gerencia os muitos, muitos receptores ativos localizados na membrana celular. Isto será importante para pensar sobre o que podemos esperar acerca de uma das possíveis maneiras de como um aptâmero visando o FGFR3 poderia funcionar.

Como eu disse, existem centenas de diferentes receptores instalados através da membrana celular, todos funcionando como antenas químicas para ajudar a célula a reagir ao que está acontecendo no seu meio. Da resposta imune à apoptose, um número incrível de interações celulares guiadas por essas antenas já foram descritas.

No entanto, estas antenas não são permanentes. Como em qualquer processo biológico para manter a vida em equilíbrio, há um certo número de sistemas de controle que regulam o tempo de ação desses receptores. Quando uma enzima receptora, vamos dizer o FGFR3, é ativada por um ligante (um FGF), forma um complexo molecular que começa a transmitir sinais às suas cascatas químicas específicas (revisto aqui) e, a seguir, é atraída para o interior da célula. Então, este complexo é identificado por proteínas como a ubiquitina, que irá marcá-lo e conduzi-lo aos sistemas de degradação, onde as proteínas são desfeitas. Ao usar estes sistemas de controle, a célula é capaz de regular o tempo que um receptor pode conduzir sinais do exterior para o núcleo da célula. Você consegue ver para onde estamos indo?

Aptâmeros concebidos para se ligar EGFR2 (HERB2) fazem com que a sua degradação seja acelerada e reduzem o crescimento do câncer.

Em um estudo recente, pesquisadores identificaram um par de aptâmeros específicos para o EGFR2. O EGFR2 é uma das quatro enzimas receptoras da família EGFR e é um importante fator estimulante em algumas formas de câncer de mama e outros cânceres. O bloqueio ou desativação do EGFR2 causa redução do crescimento do tumor e reduz a taxa de recidiva em casos devidamente tratados. Neste estudo, Mahlknecht G et al. (3) realizaram vários testes com aptâmeros por eles identificados e descobriram que eles agiam forçando a degradação do receptor sem que ele tivesse sido ativado. Isto, por sua vez, resultou na inibição do crescimento do tumor nos modelos usados nos testes. Os aptâmeros testados não mostraram maiores problemas em termos de toxicidade, o que também é uma informação importante.

Em resumo, este estudo evidenciou que um aptâmero com um alvo localizado no exterior da célula é capaz de bloquear a sua função e causa o efeito previsto (aqui, a inibição do crescimento do tumor). A mesma estratégia pode ser aplicada para o FGFR3.

A estratégia de usar aptâmeros para acondroplasia pode ter vantagens:
  • Aptâmeros são pequenas moléculas provavelmente capazes de transitar livres na placa de crescimento e de alcançar o condrócito;
  • Aptâmeros são muito específicos, tornando baixo o risco de causar efeitos fora- do-alvo (quando um medicamento provoca efeitos indesejados ou inesperados devido à interação com um alvo não pretendido);
  • Aptâmeros costumam ter um perfil de risco baixo de toxicidade.

No entanto, aptâmeros são um pouco frágeis e vítimas naturais do sistema enzimático do corpo. Eles precisam de proteção para alcançar os seus objetivos. Isto pode ser conseguido com o acoplamento de transportadores e disfarces, com um dos vários sistemas já disponíveis (analisamos isso aqui). Este obstáculo não é nada que não possa ser solucionado.

Concluindo

No final de 2012, em uma conversa com um especialista no desenvolvimento de medicamentos e de investimento de capital de risco, mencionei os aptâmeros como uma estratégia a ser explorada como uma terapia potencial para a acondroplasia, mas este especialista se mostrou cético sobre eles. Minha opinião é que não sabemos. Desde que aprendi sobre os aptâmeros tenho feito buscas em bancos de dados médicos, tais como o Pubmed e nunca encontrei um estudo testando aptâmeros contra o FGFR3. Aqui, o desafio é novamente encontrar um investigador com a mente aberta e com recursos adequados, para explorar a possibilidade de aptâmeros serem usados ​​para tratar a acondroplasia.


Referências

1. Tuerk C, Gold L. Systematic evolution of ligands by exponential enrichment: RNA ligands to bacteriophage T4 DNA polymerase. Science 1990; 249 (4968): 505-10. 

2. Ellington AD, Szostak JW. In vitro selection of RNA molecules that bind specific ligands. Nature 1990; 346(6287):818–22.

3. Mahlknecht G et al. Aptamer to ErbB-2/HER2 enhances degradation of the target and inhibits tumorigenic growth. PNAS 2013; 110 (20): 8170-8175.