domingo, 27 de março de 2016

Bloqueando la producción del FGFR3 para tratar la acondroplasia (1ª parte)

Traducción: Maria Cristina Terceros

Introducción

El blog tiene en la actualidad 24 seguidores (es lo que dice Google…) Esos lectores resilientes probablemente piensan que repito demasiado la misma información, ya que los artículos muchas veces comienzan con conceptos básicos sobre la acondroplasia antes de entrar directamente en el tema. Eso es verdad, pero yo sé que a veces otros visitantes pasan por aquí, por lo que es bueno intentar ponerlos a todos a un mismo nivel. A fin de cuentas, siempre intento incluir algo nuevo en estas introducciones (¡lo que es verdad también en esta de aquí!)

Releyendo los artículos más recientes, me doy cuenta de que, a veces, el lenguaje y las explicaciones pueden parecer difíciles de ser comprendidos para el lector de primer viaje. Si éste cree que está siendo difícil entender algunos de los temas comentados aquí, puede dar un vistazo a los primeros artículos del blog, escritos en 2012. Ellos podrán ayudar a circular más fácilmente a través de los nuevos. Por ejemplo, el tema de este artículo ya fue visto anteriormente en otros tres artículos de 2012:
Y, en 2013, escribí otro artículo sobre este tema:
 Será de utilidad leerlos antes de continuar, ya que el tema tiene sus complejidades.

Algunas informaciones básicas

La acondroplasia es causada por una mutación en el gen FGFR3, el cual codifica  (contiene las instrucciones para la producción de) 
una proteína llamada receptor del factor de crecimiento del fibroblasto tipo 3 (FGFR3) (1,2). El FGFR3 tiene un papel fundamental en el desarrollo óseo, que es el de reducir la velocidad del crecimiento del hueso (3). Funciona como un freno en el interior de las estrechas regiones localizadas dentro de ambas extremidades de los huesos largos llamadas placas de crecimiento (Figura 1). Las placas de crecimiento son las estructuras responsables por el alargamiento de los huesos tubulares (o largos). Las células dentro de la placa de crecimiento, los condrocitos, son responsables por el crecimiento del hueso a través de un proceso bastante complejo, donde el FGFR3 forma parte de él.

Figura 1. La placa de crecimiento


En las Figuras 1 y 2 podemos observar que los condrocitos de la placa de crecimiento están posicionados de manera que, bajo el estímulo continuo de muchos agentes de crecimiento activos (incluido el FGFR3), parten de un estado de reposo (resting zone), pasan a un organizado frenesí proliferativo (proliferative zone), son sometidos a un aumento masivo de volumen (hypertrophic zone) y, finalmente, dan lugar a las células responsables por la construcción del nuevo hueso, los osteoblastos. Como un pequeño detalle, algunos autores en revisiones recientes han considerado que el tamaño de la zona hipertrófica es determinante para el alargamiento del hueso (4).

Figura 2. El ciclo de vida de los condrocitos y muchos de los agentes que participan en el desarrollo del crecimiento óseo.


Como mencionado anteriormente, el FGFR3 actúa para equilibrar el efecto de otros varios agentes que estimulan la proliferación de los condrocitos. Si no hubiese FGFR3, los huesos crecerían excesivamente, causando problemas de salud, como vemos en casos relatados en la literatura (5).

Sin embargo, en la acondroplasia, la mutación en el gen FGFR3 hace con que éste se active mucho más de lo normal, lo que a su vez lleva a la interrupción del crecimiento del hueso. Bajo el efecto de un FGFR3 superactivo, los condrocitos reducen su tasa de proliferación, y menos de ellos sufren hipertrofia (Figura 3). Con menos condrocitos madurando y creciendo, la zona hipertrófica no llega a su potencia total y vemos que hay comprometimiento en el crecimiento óseo. Básicamente, casi todas las características clínicas y las consecuencias para la salud en la acondroplasia, pueden ser explicadas a través de este mecanismo (4).

Figura 3. Placas de crecimiento de un modelo de rata con acondroplasia (derecha) y de un animal no afectado (a la izquierda).

Compare las longitudes de las zonas proliferativas (PZ) e hipertróficas (HZ) entre las placas de crecimiento normal y afectada. Adaptado y reproducido aquí de Yingcai W et al. PNAS 1999;96:4455-60, solamente con fines educativos.
La actividad del FGFR3 depende de las señales que llegan de afuera de los condrocitos. En la Figura 4, se puede ver que el FGFR3 es como una antena de TV, colocada en el tejado de la casa (membrana celular). Éste recibe señales químicos traídos por factores de crecimiento de fibroblastos (FGFs) que circulan en las cercanías de los condrocitos, en el interior de la placa de crecimiento. Cuando un FGF enciende la antena, una señal química atraviesa el cuerpo de la antena (el cuerpo del FGFR3) y enciende otras varias cascadas químicas en el interior de los condrocitos (6). Digamos que es el FGFR3 activo “apretando botones en el panel de control de la célula”.

Figura 4. Las cascadas químicas intracelulares del FGFR3 (de Nature Reviews Cancer 2005).


Los científicos cuentan ahora con una buena comprensión de cómo el FGFR3 actúa en los condrocitos, los “botones” que aprieta para hacer con que los condrocitos paren de crecer, aunque no es raro que traigan más detalles para este proceso.

Aprender sobre el mecanismo de acción de las proteínas, tales como el FGFR3, es como crear un mapa de carreteras destacando sus cruzamientos, puntos de chequeos, estaciones de tren, etc. Ese mapeamiento permite que los investigadores trabajen en soluciones para superar la falta o el exceso de actividad de esas proteínas. Muchas terapias actuales para un gran número de enfermedades han sido creadas con la ayuda de esos mapas, una vez que ayudan a encontrar los objetivos correctos para combatir una determinada condición médica.

Pensando en terapias para la acondroplasia, como también para otras muchas enfermedades causadas por una única proteína hiperactiva, el movimiento natural es el de encontrar un agente que pueda interrumpir a esa proteína de ejercer su función. Teóricamente, eso podría ayudar a revertir o a minimizar sus efectos.

Se puede conseguir interrumpir la acción del FGFR3 a través de variadas y diferentes vías (observa las “estaciones de tren” en el mapa de la cascada de señalización en la Figura 3), desde bloquear la recepción de la señal de la antena o a través del bloqueo de los botones en el panel de control hasta el de contrabalancear el efecto de una de aquellas cascadas químicas, a través del estímulo de una cascada antagonista.

La mayoría de esas estrategias ya fue revisada aquí en el blog. Por ejemplo, podemos bloquear la antena con anticuerpos concebidos para que se conecten con ella. Existen por lo menos tres anticuerpos contra el FGFR3 publicados en la literatura, los cuales han sido explorados en estudios clínicos para el cáncer activado por FGFR3 (ver este artículo).

Podemos bloquear los botones en el panel de control con pequeñas moléculas llamadas inhibidores de tirosina quinasa (TKI). Hay muchas TKIs disponibles, pero hasta ahora ninguna lo suficientemente buena como para ser usada en la acondroplasia (ver este 
artículo). Y se puede también estimular otra antena de la célula (otro receptor) para reducir la actividad del FGFR3, como observamos con el vosoritide, un análogo del péptido natriurético tipo C (CNP), actualmente en un estudio clínico de fase 2 para la acondroplasia. El vosoritide imita al CNP al unirse a su receptor localizado en la membrana celular del condrocito (como el FGFR3). El receptor es activado y su señalización intercepta la MAPK, la principal cascada de señalización del FGFR3, inhibiéndola en el nivel de la “estación del tren” RAF (Figura 5) (ver este artículo).

Figura 5. La cascada de señalización del CNP intercepta la cascada MAPK desencadenada por el FGFR3.
Matsushita M et al. (2013). PLoS ONE 8 (12): e81569. Reproducido aquí apenas con fines ilustrativos.
Éstos son apenas algunos ejemplos entre otras diversas estrategias que ya están siendo exploradas para la acondroplasia (ver este artículo). Sin embargo, existen otros tipos de abordaje que podrían ser adecuados para controlar o regularizar el FGFR3 y, después de esta larga introducción, vamos a hablar sobre una de ellas, que sería la de bloquear la producción del FGFR3 (está en el título, ¿no es verdad?) En realidad, ya la revisamos aquí en el blog (¡los artículos en lo alto de este texto! ¿Llegaron a leerlos?) Pero, como hay nueva información que va llegando, pensé que valdría la pena hablar sobre ella nuevamente. A fin de cuentas, está estrategia podría ayudarnos, más adelante, a entrar en otra nueva estrategia en potencial que también trabaja con DNA, RNA y maquinaria de transcripción de genes.

Regulando el regulador

Como sabemos, nuestro DNA es una especie de caja fuerte donde es almacenada la información química necesaria para crear las proteínas fundamentales para nuestro cuerpo. La vida es un proceso dinámico y existe siempre la necesidad de producir nuevas proteínas, de manera que las células, tejidos y el cuerpo puedan funcionar normalmente como un todo (Animación 1, inglés, 2:41min).

Animación 1. Desde el DNA hasta la proteína (yourgenome.org).


La forma como el proceso por el cual el DNA es “leído” y “copiado” para generar proteínas, frecuentemente puede llevar a estados en que algun gen que codifica la información para generar una proteína podría permanecer ampliamente “abierto” para ser “leído”, de manera que la proteína podría ser producida sin parar. Esto, a su vez, podría dar como resultado, problemas de salud. Por ejemplo, algunos tipos de células cancerígenas, como ser en el cáncer de mama, son capaces de iniciar la superproducción de “antenas”, tales como nuestro FGFR3, para captar más señales externas en circulación que estimulan todavía más el crecimiento del cáncer.

En condiciones normales, este exceso de producción de proteínas no se da porque la célula tiene diferentes medidas de control de calidad que funcionan para regular este proceso. Una de ellas está constituida por moléculas de RNA.

Pero, aquí vayamos lentamente, paso a paso. Recuerdo que, en mi época de colegio, cuando comencé a estudiar biología celular, existían tres tipos clásicos de RNA: RNA mensajero (mRNA), RNA de transferencia (tRNA) y RNA ribosómico (todos ellos aparecen en la animación anterior). Bien, desde entonces, la lista de los tipos de RNA no paró de crecer. Podemos dar un vistazo en esta página de Wikipedia (en inglés) para obtener una lista de tipos de RNA ya identificados.

Algunas de estas moléculas de RNA están bastante involucradas en el proceso de control de la producción de proteínas y el enfoque aquí está en la familia microRNA, o simplemente miRNA (ya visto en los artículos mencionados anteriormente). Se demostró que esas moléculas de RNA controlan la cantidad de proteínas producidas por la célula. Les invito a que vean la Animación 2, (Inglés, 4:53min) de Katarina Petsche, quien nos da una visión global de la síntesis del miRNA y de cómo éste funciona:

Animación 2. La síntesis y el mecanismo de acción del miRNA (por Katarina Petsche).


Básicamente, debido a la capacidad de degradación de mRNAs, los miRNAs han sido clasificados como moléculas "silenciadoras de genes". Como la proteína-objetivo no es producida, es como si el gen no estuviese funcionando (o apagado, silenciado).

Existen millones de miRNAs diferentes y cada uno de ellos fue concebido para unir a un número limitado de mRNAs. Ya fueron identificados varios miRNAs, como ser el miRNA-100 (o miR-100), que se une al mRNA del FGFR3, pero aquí tenemos un problema. Si bien los miRNAs son bastante específicos con sus objetivos, estos objetivos no son únicos. Cuando pensamos en “silenciamiento” de un gen específico, por ejemplo el FGFR3 en la acondroplasia, no significa que se quiera “silenciar” otros genes-objetivos, ya que eso podría conducir a otros problemas de salud.

Entre los variados miRNAs que mostraron que ejercían una función de control sobre el FGFR3, el miR-100 parece ser uno de los más relevantes, ya que existen evidencias de que éste realmente controla el FGFR3. Diferentes estudios publicados recientemente exploraron la unión entre el miR-100 y el FGFR3 en el cáncer pancreático (7), el glioblastoma (8), el sarcoma (9) y en células de cáncer de pulmón (10) y mostraron que, en las células que "súper producen" miR-100 había menos FGFR3 disponible y vice-versa, y todos concluyeron que el miR-100 fue capaz de inhibir el crecimiento del cáncer en sus experiencias. No debemos sentirnos confundidos ante el hecho de que el FGFR3 sea usado por las células cancerígenas para crecer. Esto sucede porque el FGFR3 es un freno solamente para los condrocitos de la placa de crecimiento; en otras células éste funciona como un acelerador… Estos tipos de descubrimientos pueden llevar al desarrollo de una nueva estrategia de estímulo de expresión (de producción) de miR-100 en las células cancerígenas que utilizan el FGFR3 para crecer, para silenciar el gen FGFR3 y combatir el tumor.

Entonces, si un abordaje como éste puede ser usado para el tratamiento contra el cáncer, ¿serían adecuados el miR-100 u otros miRNAs para el tratamiento de la acondroplasia?

Probablemente no, porque, aunque exista evidencia de que ellos inhiben al FGFR3, también existen otras proteínas que pueden verse afectadas por sus acciones, lo que también podría acarrear problemas indeseables. En resumen, los miRNAs no son lo suficientemente específicos.

Bien, entonces, ¿cuál sería el objetivo de esta revisión? El tema es que los investigadores fueron capaces de crear, en laboratorio, otro tipo de RNA que hace básicamente lo mismo que los miRNAs (aprender un poco sobre uno, es aprender sobre el otro…). Sin embargo, existe una diferencia importante: como es sintetizado en el laboratorio, probablemente tendrá una especificidad mucho más grande para el FGFR3. Esta molécula de RNA sintética es llamada de pequeño RNA de interferencia (small interference RNA) o simplemente siRNA. Estudios ya realizados muestran que los siRNAs usan la misma maquinaria celular y causan efectos similares a los de los miRNAs (11). Los investigadores tienen que introducir el siRNA en el interior de la célula y después ver que éste funciona como un miRNA. Actualmente, un abordaje “simple” para probar que un gen se une a una determinada función se da en la aplicación de un siRNA específico y en la observación de los efectos de silenciamiento de aquel gen.  Por ejemplo, eso fue realizado en diferentes contextos de enfermedades (11) y también en la acondroplasia, en un estudio realizado por Pintor y Legeai-Mallet (12).

Si has leído el artículo de 2013 sobre RNAs sabes que por lo menos una empresa de biotecnología con sede en los Estados Unidos de América (Marina Biotech) patentó una estrategia de interferencia de RNA como posiblemente útil para el tratamiento de la acondroplasia (13). Ahora, descubrí otra patente para el uso de moléculas de ácidos nucleicos para tratar la acondroplasia (14) (Santaris Pharma, Roche), entonces parece que ha habido algunos intentos recientes para llegar al FGFR3 en la acondroplasia usando la estrategia siRNA.

No sabemos si estos abordajes llegarán al desarrollo clínico, debido a que uno de los principales desafíos para las terapias en base a ácidos nucleicos (el RNA está compuesto por ácidos nucleicos, como ya sabes) es cómo hacer con que esos agentes alcancen sus objetivos. Como las moléculas de RNA son tan poderosas, el cuerpo tiene un gran número de agentes de protección para garantizar que esas moléculas no circularán libremente por mucho tiempo. El RNA es el código genético de muchos virus causantes de enfermedades, y el cuerpo debe estar preparado para liberarse de ácidos nucleicos extraños, para defenderse de infecciones. Por lo tanto, las moléculas de RNA tienden a ser rápidamente degradadas por enzimas neutralizantes, y esto podría explicar en parte por qué no vemos progresos rápidos en esta área. Para la acondroplasia, el desafío es todavía más grande, debido a que las células objetivo, los condrocitos, están en un ambiente bastante protegido, el cartílago de la placa de crecimiento, un lugar difícil de ser alcanzado (ver este artículo anterior del blog).

Entregando la encomienda

La entrega a domicilio es realmente un desafío, y es por este motivo que usé el verbo “introducir” cuando describí el uso del siRNA tres párrafos antes. No es fácil hacer con que las moléculas de RNA lleguen al interior de las células, es necesario usarse un taxi (lo que se llama de transportador, vector, etc.), o un disfraz. Por ejemplo, en varios estudios fueron aplicados apéndices en la molécula del RNA, lo que las hizo más estables y resistentes a la neutralización por enzimas. En enfermedades donde la célula objetivo se encuentra en un tejido con flujo directo de sangre, esto puede ser suficiente para permitir con que el siRNA entre en la célula, pero en un tejido como la placa de crecimiento, donde no existe un flujo sanguíneo directo, ¿cómo es que esto puede ser alcanzado?

Aquí no se trata de una cuestión trivial. Una posible estrategia para hacer con que una droga llegue a su objetivo es encontrar algo que solamente ese objetivo posee (como un marcador), cosa que no es tarea fácil, pero aun así se trata de algo viable. En el caso de los condrocitos de la placa de crecimiento, posiblemente uno de estos marcadores es un receptor celular (otra antena) llamado CD44. El problema aquí es que el CD44 es expresado por muchas células diferentes. Entonces, ¿se trata de algo inútil? Tal vez no, porque la mayoría de las células que poseen CD44 no expresan el FGFR3 en un nivel significativo, de manera que la influencia de un siRNA contra el FGFR3 en ellas, posiblemente no iría a causar cualquier problema. La idea sería anexar o cubrir la molécula de RNA a otra molécula que podría unirse al CD44. Una vez unido, el sistema celular que mantiene el equilibrio de las antenas traería este CD44 ocupado hacia el interior de la célula, donde el siRNA sería liberado para encontrar su objetivo y ejercer su función esperada. Ésta es apenas una idea personal, nunca encontré un trabajo que explorase este abordaje específicamente en esta área.

Conclusión

Podría parecer que esta revisión no ayudó mucho en términos de traer una nueva terapia potencialmente espectacular para la acondroplasia. Sería más como una revisión general de la enfermedad, una vez que el blog ya tiene artículos sobre miRNAs y siRNAs. Sin embargo, no estamos perdiendo tiempo: los procesos aquí brevemente mencionados, servirán para ayudarnos a viajar por un proceso todavía más complejo, la edición de genes (gene editing), una potencial estrategia terapéutica que se encuentra en este momento bajo las luces de los reflectores.

¿Podría ser usada para el tratamiento de la acondroplasia?

Por lo que ya aprendí hasta ahora, diría que sí, pero vamos a ver en el próximo artículo. Aún me encuentro estudiando este tópico
...

Referencias

1.Bellus GA et al. Achondroplasia is defined by recurrent G380R mutations of FGFR3. Am J Hum Genet 1995;56(2):368-73Free access.

2.
Rousseau F et al. Mutations in the gene encoding fibroblast growth factor receptor-3 in achondroplasia. Nature 1994;371(6494):252-4. Free access.

3. 
Laederich MB and Horton WA. FGFR3 targeting strategies for achondroplasia.Expert Rev Mol Med 2012;14:e11.

4. 
Narayana J and Horton WA. FGFR3 biology and skeletal disease. Connect Tissue Res 2015;56(6):427-33. 

5. 
Makrythanasis P et al. A novel homozygous mutation in FGFR3 causes tall stature, severe lateral tibial deviation, scoliosis, hearing impairment, camptodactyly, and arachnodactyly. Hum Mutat 2014;35(8):959-63.

6. 
Ornitz DM and Marie PJ. Fibroblast growth factor signaling in skeletal development and disease. Genes Dev. 2015 Jul 15;29(14):1463-86. Free access.7. Li Z et al. MicroRNA-100 regulates pancreatic cancer cells growth and sensitivity to chemotherapy through targeting FGFR3. Tumour Biol 2014;35(12):11751-9.

8. 
Luan Y et al. Overexpression of miR-100 inhibits cell proliferation, migration, and chemosensitivity in human glioblastoma through FGFR3. Onco Targets Ther 2015;8: 3391-400. Free access.

9. 
Bi Y et al. Overexpression of miR-100 inhibits growth of osteosarcoma through FGFR3.Tumour Biol 2015;36(11):8405-11.

10. 
Luo J et al. Overexpression of miR-100 inhibits cancer growth, migration, and chemosensitivity in human NSCLC cells through fibroblast growth factor receptor 3.Tumour Biol 2015; published online Aug 28. DOI 10.1007/s13277-015-3850-z. 

11.
Videira M et al. Preclinical development of siRNA therapeutics: towards the match between fundamental science and engineered systems.Nanomedicine 2014;10(4):689-702.

12. 
Guzman-Aránguez A, Legeai‐Mallet L, Pintor J. Fibroblast growth factor receptor 3 inhibition by small interfering RNAs in achondroplasia. Anales Real Acad Nac Farm 2011; 77(1).

13. Marina Biotech Patent WO 2011139842 A2. Nucleic acid compounds for inhibiting fgfr3 gene expression and uses thereof.

14. Santaris Pharma WO 2014080004 A1. Compositions and methods for modulation of fgfr3 expression.

terça-feira, 15 de março de 2016

Bloqueando a produção do FGFR3 para tratar a acondroplasia (parte 1)

Introdução

O blog tem atualmente 24 seguidores (é o que Google diz ...). Esses resilientes leitores provavelmente pensam que eu repito demais a mesma informação, pois os artigos muitas vezes começam com conceitos básicos sobre a acondroplasia antes de entrar no assunto. Isso é verdade, mas eu sei que às vezes outros visitantes passam por aqui, então é bom tentar colocar todos no mesmo passo. E, afinal de contas, sempre procuro incluir algo novo nessas introduções (e isso é verdade nesta aqui, também!).

Lendo novamente os artigos mais recentes, percebo que a linguagem e explicações, por vezes, podem parecer difíceis de entender para o leitor de primeira viagem. Se você acha que está sendo difícil entender alguns dos temas comentados aqui, dê uma olhada nos primeiros artigos do blog, escritos em 2012. Eles podem ajudar a trafegar mais facilmente através dos novos. Por exemplo, o tema deste artigo foi revisto em três artigos de 2012:

24/01/2012. Mirando na produção do FGFR3 para resgatar o crescimento ósseo na acondroplasia
12/02/2012. O mundo do RNA: desligando o FGFR3 na acondroplasia 

20/02/2012. O mundo do RNA: desligando o FGFR3 na acondroplasia, parte 2

E, em 2013, escrevi um outro artigo sobre este assunto:

18/06/2013. Interferindo na produção do FGFR3: uma potencial estratégia para tratar a acondroplasia


Pode ser útil você lê-los antes de continuar aqui, porque o tema tem suas complexidades.

Algumas informações básicas

A acondroplasia é causada por uma mutação no gene FGFR3, o qual codifica a (contem as instruções para a produção de) proteína chamada receptor de fator de crescimento de fibroblastos 3 (FGFR3) (1,2). O FGFR3 tem um papel fundamental no desenvolvimento ósseo, que é o de reduzir a velocidade de crescimento do osso (3). Ele funciona como um freio no interior das estreitas regiões localizadas em ambas as extremidades dos ossos longos chamadas de placas de crescimento (Figura 1). As placas de crescimento são as estruturas responsáveis ​​pelo alongamento dos ossos tubulares (ou longos). As células no interior da placa de crescimento, os condrócitos, são responsáveis pelo crescimento do osso através de um processo muito complexo, e o FGFR3 é parte dele.

Figura 1. A placa de crescimento.


 

Nas Figuras 1 e 2 você pode ver que os condrócitos da placa de crescimento são posicionados de uma forma que, sob estímulo contínuo de muitos agentes de crescimento ativos (FGFR3 incluído), partem de um estado de repouso (resting zone), passam por um organizado frenesi proliferativo (proliferative zone), são submetidos a um aumento maciço de volume (hypertrophic zone) e, finalmente, dão lugar às células responsáveis ​​pela construção do novo osso, os osteoblastos. Como um pequeno detalhe, alguns autores em revisões recentes têm considerado que o tamanho da zona hipertrófica é determinante para o alongamento do osso (4).

Figura 2. O ciclo de vida dos condrócitos e muitos dos agentes que participam no desenvolvimento do crescimento ósseo.



Como mencionado acima, o FGFR3 atua para equilibrar o efeito de vários outros agentes que estimulam a proliferação de condrócitos. Se não houvesse FGFR3, os ossos cresceriam excessivamente causando problemas de saúde, como vemos em casos relatados na literatura (5).

No entanto, na acondroplasia, a mutação no gene FGFR3 faz o FGFR3 ficar mais ativo do que o normal, o que por sua vez leva à interrupção do crescimento do osso. Sob o efeito de um FGFR3 superativo, condrócitos reduzem sua taxa de proliferação e menos deles sofrem hipertrofia (Figura 3). Com menos condrócitos amadurecendo e crescendo, a zona hipertrófica não atinge o seu pleno potencial e temos comprometimento do crescimento ósseo. Basicamente, quase todas as características clínicas e consequências para a saúde na acondroplasia podem ser explicadas por este mecanismo (4).

Figura 3. Placas de crescimento de um modelo de rato com acondroplasia (direita) e de um animal não afetado (à esquerda).


Compare os comprimentos das zonas proliferativas (PZ) e hipertroficas (HZ) entre as placas de crescimento normal e afetada. Adaptado e reproduzido aqui de Yingcai W et al. PNAS 1999;96:4455-60, somente para fins educativos.
A atividade do FGFR3 depende de sinais que vêm de fora dos condrócitos. Na Figura 4 você pode ver que o FGFR3 é como uma antena de TV, colocada no telhado da casa (membrana celular). Ele recebe sinais químicos trazidos por fatores de crescimento de fibroblastos (FGFs) que circulam na proximidade dos condrócitos, no interior da placa de crescimento. Quando um FGF liga a antena, um sinal químico atravessa o corpo da antena (o corpo do FGFR3) e aciona várias outras cascatas químicas no interior dos condrócitos (6). Digamos que é o FGFR3 ativo "apertando botões no painel de controle da célula".

Figura 4. As cascatas químicas intracelulares do FGFR3 (da Nature Reviews Cancer 2005).



Os cientistas têm agora uma boa compreensão de como o FGFR3 exerce a sua ação nos condrócitos, os "botões" que aperta para fazer os condrócitos pararem de crescer, embora não raro tragam mais detalhes para este processo.

Aprender sobre o mecanismo de ação das proteínas, tais como o FGFR3, é como criar um mapa com estradas destacando seus cruzamentos, pontos de checagem, estações de trem etc. Esse mapeamento permite que os pesquisadores trabalhem em soluções para superar a falta ou excesso de atividade dessas proteínas. Muitas terapias atuais para um grande número de doenças têm sido criadas com a ajuda desses mapas, uma vez que ajudam a encontrar os alvos corretos para combater uma determinada condição médica.

Pensando em terapias para a acondroplasia, como também para outras muitas doenças genéticas causadas por uma única proteína hiperativa, o movimento natural é o de encontrar um agente que possa interromper essa proteína de exercer a sua função. Teoricamente, isso poderia ajudar a reverter ou minimizar os seus efeitos.

Pode-se conseguir interromper a ação do FGFR3 por várias vias diferentes (olhe as "estações de trem" no mapa da cascata de sinalização na Figura 3), desde bloquear a recepção do sinal pela antena ou pelo bloqueio dos botões no painel de controle até o de contrabalançar o efeito de uma daquelas cascatas químicas, através do estímulo de uma cascata antagonista.

A maioria dessas estratégias já foi revista aqui no blog. Por exemplo, você pode bloquear a antena com anticorpos concebidos para conectarem-se a ela. Existem pelo menos três anticorpos contra o FGFR3 publicados na literatura, os quais têm sido explorados em estudos clínicos para o câncer ativado por FGFR3 (veja este artigo).

Você pode bloquear os botões no painel de controle com pequenas moléculas chamadas inibidores de tirosina quinase (TKI). Há muitos TKI disponíveis, mas até agora nenhum bom o suficiente para ser usado na acondroplasia (veja este artigo). E você também pode estimular outra antena da célula (outro receptor) para reduzir a atividade do FGFR3, como observamos com o vosoritide, um análogo do peptídeo natriurético tipo C (CNP), atualmente em um estudo clínico de fase 2 para a acondroplasia.O vosoritide imita o CNP ao se ligar ao seu receptor localizado na membrana celular do condrócito (como o FGFR3). O receptor é ativado e sua sinalização intercepta a MAPK, a principal cascata de sinalização do FGFR3, inibindo-a ao nível da "estação de trem" RAF (Figura 5) (veja este artigo).

Figura 5. A cascata de sinalização do CNP intercepta a cascata MAPK desencadeada pelo FGFR3.


Matsushita M et al. (2013). PLoS ONE 8 (12): e81569. Reproduzido aqui apenas para fins ilustrativos


Estes são apenas alguns exemplos entre outras diversas estratégias que já estão sendo exploradas para a acondroplasia (veja este artigo). No entanto, há outros tipos de abordagem que poderiam ser adequadas para controlar ou regular o FGFR3 e, depois desta longa introdução, vamos falar sobre uma delas, que seria a de bloquear a produção do FGFR3 (está no título, não é?). Na verdade, já a revisamos aqui no blog (os artigos noa no topo deste texto!, você chegou a lê-los?), Mas como há nova informação chegando, pensei que valeria a pena falar sobre ela novamente. Afinal, essa estratégia poderá nos ajudar a entrar em outra nova estratégia potencial que também lida com DNA, RNA e a maquinaria de transcrição de genes mais adiante.

Regulando o regulador

Como você deve saber, nosso DNA é uma espécie de cofre onde a informação química necessária para criar as proteínas fundamentais para o nosso corpo é armazenado. A vida é um processo dinâmico e existe sempre a necessidade de produzir novas proteínas de modo que as células, tecidos e o corpo como um todo possam funcionar normalmente (Animação 1, Inglês, 2:41min).

Animação 1. Do DNA à proteína (yourgenome.org).




A forma como o processo pelo qual o DNA é "lido" e "copiado" para gerar proteínas frequentemente pode conduzir a estados em que um determinado gene que codifica a informação para gerar uma proteína poderia ficar longamente "aberto" para ser "lido", de modo que a proteína poderia ser produzida sem parar. Isto, por sua vez, pode resultar em problemas de saúde. Por exemplo, alguns tipos de células cancerosas, como no câncer de mama, são capazes de iniciar a superprodução de "antenas", tais como o nosso FGFR3, para captar mais sinais externos
em circulação que estimulam ainda mais o crescimento do câncer.

Em condições normais, este excesso de produção de proteínas não ocorre porque a célula tem várias medidas de controle de qualidade que funcionam para regular este processo. Uma delas é constituída por moléculas de RNA.

Mas, vamos devagar aqui, passo a passo. Lembro-me que, nos meus tempos de colégio, quando comecei a estudar biologia celular, havia três tipos clássicos de RNA: RNA mensageiro (mRNA), o RNA de transferência (tRNA) e o RNA ribossomal (todos eles aparecem na animação acima). Bem, desde então, a lista de tipos de RNA não parou de crescer. Dê uma olhada nesta página da Wikipedia (em inglês) para obter uma lista de tipos de RNA já identificados.

Algumas destas moléculas de RNA estão
muito envolvidas no processo de controle da produção de proteínas e o foco aqui é a família microRNA, ou simplesmente miRNA (revisto nos artigos mencionados acima). Demonstrou-se que essas moléculas de RNA controlam a quantidade de proteínas produzidas pela célula. Convido você a assistir à Animação 2 (Inglês, 4:53min) por Katarina Petsche, a qual dá uma visão global da síntese do miRNA e de como ele funciona:

Animação 2. A síntese e mecanismo de ação do miRNA (por Katarina Petsche).





Basicamente, devido à capacidade de degradação de mRNAs, os miRNAs têm sido classificados como moléculas "silenciadoras de genes". Como a proteína-alvo não é produzida, é como se o gene não estivesse funcionando (ou desligado, silenciado).

Há milhares de miRNAs
diferentes e cada um deles foi concebido para se ligar a um número limitado de mRNAs. Já se identificou vários miRNAs, tais como o miRNA-100 (ou miR-100), que se ligam ao mRNA do FGFR3, mas aqui temos um problema. Embora os miRNAs sejam muito específicos para os seus alvos, seus alvos não são únicos. Quando você pensa em "silenciamento" de um gene específico, digamos o FGFR3 na acondroplasia, não quer "silenciar" outros genes-alvo, uma vez que isso poderia levar a outros problemas de saúde.

Entre os vários miRNAs que mostraram exercer uma função de controle sobre o FGFR3, o miR-100 parece ser um dos mais relevantes, uma vez que há evidências de que ele realmente controla o FGFR3. Diversos estudos publicados recentemente exploraram a ligação entre o miR-100 e o FGFR3 no câncer pancreático (7), glioblastoma (8), sarcoma (9) e em células de
câncer de pulmão (10) e mostraram que, nas células que "superproduzem" miR-100 havia menos FGFR3 disponível e vice-versa, e todos concluíram que o miR-100 foi capaz de inibir o crescimento do câncer nas suas experiências. Não se sinta confuso sobre o fato de que o FGFR3 é usado pelas células cancerosas paraa crescer. Isso acontece porque o FGFR3 é um freio somente para os condrócitos da placa de crescimento; em outras células ele funciona como um acelerador ... Estes tipos de descobertas podem conduzir ao desenvolvimento de uma estratégia de estímulo de expressão (de produção) de miR-100 nas células de câncer que utilizam o FGFR3 para crescer, para silenciar o gene FGFR3 e combater o tumor.

Então, se uma abordagem como essa poderia ser usada para o tratamento do
câncer, o miR-100 ou outros miRNAs são adequados para tratar a acondroplasia?

Provavelmente não, porque, embora exista evidência de que eles inibem o FGFR3, também existem outras proteínas que podem ser afetadas por suas ações, o que poderia trazer problemas indesejáveis. Em resumo, miRNAs não são suficientemente específicos.

Bem, então, qual é o objetivo desta revisão? A coisa é que os pesquisadores foram capazes de criar, em laboratório, um outro tipo de RNA que faz basicamente o mesmo que que os miRNAs (aprender um pouco sobre um, é aprender sobre o outro...). No entanto, há uma diferença importante: como é sintetizado no laboratório, provavelmente terá
especificidade muito maior para o FGFR3. Esta molécula de RNA sintética é chamada de pequeno RNA de interferência (small interference RNA) ou simplesmente siRNA. Estudos já realizados mostram que siRNAs usam a mesma maquinaria celular e causam efeitos similares aos dos miRNAs (11). Os investigadores têm de introduzir o siRNA no interior da célula e depois ele funciona como um miRNA. Hoje em dia, uma abordagem "simples" para provar que um gene é ligado a uma determinada função é a de aplicar um siRNA específico e observar os efeitos de silenciamento daquele gene. Por exemplo, isso foi feito em diversos contextos de doenças (11) e também na acondroplasia, em um estudo realizado por Pintor e Legeai-Mallet (12).

Se você leu o artigo de 2013 sobre RNAs você já sabe que pelo menos uma empresa de biotecnologia com sede nos EUA (Marina Biotech) patenteou uma estratégia de interferência de RNA como possivelemtne útil para o tratamento de acondroplasia (13). Agora, descobri uma outra patente para o uso de moléculas de ácidos nucleicos para tratar a acondroplasia (14) (Santaris Pharma, Roche), então parece que tem havido algumas tentativas
recentes para atingir o FGFR3 na acondroplasia usando a estratégia siRNA.

Não sabemos se estas abordagens chegarão ao desenvolvimento clínico porque um dos principais desafios para as terapias à base de ácidos nucleicos (RNA é composto por ácidos nucleicos, como você sabe) é como fazer esses agentes atingirem os seus objetivos. Como as moléculas de RNA são tão poderosas, o corpo tem um grande número de agentes de proteção para garantir que essas moléculas não trafegarão livremente por muito tempo. RNA é o código genético de muitos vírus causadores de doença, e o corpo deve estar pronto para se livrar de ácidos nucleicos estranhos para se defender de infecções. Portanto, as moléculas de RNA tendem a ser rapidamente degradados por enzimas neutralizantes, e isto poderia explicar em parte por que não vemos progressos rápidos nesta área. Para a acondroplasia, o desafio é ainda maior porque as células-alvo, os condrócitos, estão em um ambiente muito bem protegido, a cartilagem da placa de crescimento, um lugar difícil de alcançar (ver este artigo anterior do blog).

Entregando a encomenda

A entrega a domicílio é realmente um desafio, e por esta razão usei o verbo "introduzir" quando eu descrevi o uso do siRNA três parágrafos acima. Não é fácil fazer moléculas de RNA chegarem ao interior das células, você precisa usar um táxi (o que se chama de transportador, vetor etc.) ou um disfarce. Por exemplo, em vários estudos foram aplicados apêndices na molécula de RNA, o que as tornou mais estáveis ​​e resistentes à neutralização por enzimas. Em doenças em que a célula alvo está num tecido com fluxo direto de sangue, isto pode ser suficiente para permitir que o siRNA entre na célula, mas em um tecido, tal como a placa de crescimento, onde não existe um fluxo sanguíneo direto, como isso pode ser alcançado?

Esta não é uma questão trivial. Uma estratégia possível para fazer uma droga chegar ao seu alvo é encontrar algo que somente esse alvo tem (como um marcador), o que não é uma tarefa fácil, mas ainda assim viável. No caso
dos condrócitos da placa de crescimento possivelmente um destes marcadores é um receptor de células (outra antena) chamado CD44. O problema aqui é que o CD44 é expresso por muitas células diferentes. Então, é inútil? Talvez não, porque a maioria das células que possuem CD44 não expressam FGFR3 em um nível significativo, de modo algum influência de um siRNA contra o FGFR3 nelas possivelmente não iria causar qualquer problema. A ideia seria anexar ou cobrir a molécula de RNA a uma outra molécula que pode ligar-se ao CD44. Uma vez ligado, o sistema celular que mantem o equilíbrio das antenas traria este CD44 ocupado para o interior da célula, onde o siRNA seria liberado para encontrar o seu alvo e exercer a sua função esperada. Esta é apenas uma ideia pessoal, nunca encontrei qualquer trabalho que explorasse esta abordagem nesta área específica.

Conclusão

Pode parecer que esta revisão não ajudou muito em termos de trazer uma nova terapia potencial espetacular para acondroplasia. Seria mais como uma revisão geral da doença, uma vez que o blog já tem artigos sobre miRNAs e siRNAs. No entanto, não estamos perdendo tempo: os processos
brevemente mencionados aqui servirão para ajudar-nos a viajar por um ainda mais complexo, que é a edição de genes, uma estratégia terapêutica potencial que está sob os holofotes agora.

Poderia ser usada para tratar a acondroplasia?

Pelo que eu já aprendi, diria que sim, mas vamos ver no próximo artigo. Ainda estou estudando este tópico ...


Referências


1.Bellus GA et al. Achondroplasia is defined by recurrent G380R mutations of FGFR3. Am J Hum Genet 1995;56(2):368-73. Free access.

2.Rousseau F et al. Mutations in the gene encoding fibroblast growth factor receptor-3 in
achondroplasia. Nature 1994;371(6494):252-4. Free access.

3. Laederich MB and Horton WA. FGFR3 targeting strategies for achondroplasia.Expert Rev Mol Med 2012;14:e11.

4. Narayana J and Horton WA. FGFR3 biology and skeletal disease. Connect Tissue Res 2015;56(6):427-33.

5. Makrythanasis P et al. A novel homozygous mutation in FGFR3 causes tall stature, severe lateral tibial deviation, scoliosis, hearing impairment, camptodactyly, and arachnodactyly. Hum Mutat 2014;35(8):959-63.

6. Ornitz DM and Marie PJ. Fibroblast growth factor signaling in skeletal development and disease. Genes Dev. 2015 Jul 15;29(14):1463-86. Free access.7. Li Z et al. MicroRNA-100 regulates pancreatic cancer cells growth and sensitivity to chemotherapy through targeting FGFR3. Tumour Biol 2014;35(12):11751-9.

8. Luan Y et al. Overexpression of miR-100 inhibits cell proliferation, migration, and chemosensitivity in human glioblastoma through FGFR3. Onco Targets Ther 2015;8: 3391-400. Free access.

9. Bi Y et al. Overexpression of miR-100 inhibits growth of osteosarcoma through FGFR3.Tumour Biol 2015;36(11):8405-11.

10. Luo J et al. Overexpression of miR-100 inhibits cancer growth, migration, and chemosensitivity in human NSCLC cells through fibroblast growth factor receptor 3.Tumour Biol 2015; published online Aug 28. DOI 10.1007/s13277-015-3850-z.


11.
Videira M et al. Preclinical development of siRNA therapeutics: towards the match between fundamental science and engineered systems.Nanomedicine 2014;10(4):689-702.

12
. Guzman-Aránguez A, Legeai‐Mallet L, Pintor J. Fibroblast growth factor receptor 3 inhibition by small interfering RNAs in achondroplasia. Anales Real Acad Nac Farm 2011; 77(1).


13Marina Biotech Patent WO 2011139842 A2. Nucleic acid compounds for inhibiting fgfr3 gene expression and uses thereof.


14. Santaris Pharma WO 2014080004 A1. Compositions and methods for modulation of fgfr3 expression.

quinta-feira, 10 de março de 2016

Stopping FGFR3 production to treat achondroplasia (part 1)

Introduction

This blog currently has 24 followers (that's what Google tells me...). These resilient readers likely think I repeat the same information too much, as the articles often come with some basic concepts about achondroplasia before getting into the subject. That's true, but I know that sometimes other visitors pass by so it's good to try to have everybody in the same pace. And, after all, I always try to include a bit of new information in these short introductions (and this is true in this one, too!).

Reading again the more recent articles, I perceived that the language and explanations sometimes might sound hard to understand for the first-time reader. If you think it has been difficult to get into some of the topics we review here, take a look in the first articles of the blog, written in 2012. They may help you to travel more easily across the new ones. For instance, the topic in this article have been reviewed in three articles back in 2012:

22/01/2012. Targeting FGFR3 production to rescue bone growth in achondroplasia
04/02/2012. The RNA World: knocking down FGFR3 in achondroplasia
And, in 2013, I wrote another article about this subject:

16/06/2013. Interfering in the production of FGFR3: a potential strategy to treat achondroplasia


It may be helpful for you to read them before continuing here, because the topic has its complexities. 


Some basic information 

Achondroplasia is caused by a mutation in the gene FGFR3 that encodes (gives instruction for the production of) a protein called fibroblast growth factor receptor 3 (FGFR3) (1,2). FGFR3 has a fundamental role in bone development, which is to reduce bone growth velocity (3). It works like a brake within the thin regions located in both extremities of the long bones called growth plates (Figure 1). Growth plates are the structures responsible for long bone elongation. The cells inside the growth plate, the chondrocytes, drive bone growth through a very complex process, and FGFR3 is part of it.

Figure 1. The growth plate.



In Figures 1 and 2 you can see that the growth plate chondrocytes are organized in a way that, under continuous stimuli from many active growth agents (FGFR3 included), begin from a dormant status (resting zone), run into an organized proliferation frenzy (proliferative zone), undergo massive enlargement (hypertrophic zone) and finally give place to the cells responsible for building the new bone, the osteoblasts. As a piece of detail, some authors in recent reviews have been considering that the size of the hypertrophic zone is determinant for the elongation of the bone. (4)

Figure 2. The chondrocyte lifecycle and many of the agents participating in bone growth development.


As just mentioned above, FGFR3 acts to balance the effect of several other agents that stimulate chondrocytes to proliferate. If there was no FGFR3 at all, bones would grow excessively causing health problems, as we see in reported cases in the literature (5).

However, in achondroplasia, the mutation in the gene FGFR3 makes FGFR3 to be more active than normal, which in turn leads to bone growth arrest. Under effect of the super active FGFR3, chondrocytes reduce their proliferation rate and less of them undergo hypertrophy (Figure 3). With less chondrocytes maturing and growing, the hypertrophic zone does not reach its full potential and we have bone growth impairment. Basically, almost all the clinical features and health consequences of achondroplasia can be explained by this mechanism (4).

Figure 3. Growth plates from a mouse model of achondroplasia (right) and wild type (left).



Compare the lengths of the proliferating zones (PZ) and hypertrophic zones (HZ) between the normal and the affected growth plates. Adapted and reproduced here from Yingcai W et al. PNAS 1999;96:4455-60, for educational purposes only.
FGFR3 activity depends on signals that come from outside the chondrocytes. In figure 4 you can see that FGFR3 is like a TV antenna, placed in the roof of the house (the cell membrane). It receives chemical signals brought by fibroblast growth factors (FGFs) circulating in the vicinity of the chondrocytes inside the growth plate. When a FGF binds the antenna, a chemical signal runs across the antenna pole (the body of FGFR3) and triggers several other chemical cascades inside the chondrocytes (6). Let’s say it is the active FGFR3 “pushing buttons on the cell control panel”.

Figure 4. FGFR3 chemical cascades (from Nature Reviews Cancer 2005)


Scientists now have a good understanding of how FGFR3 exerts its action in the chondrocytes, the “buttons” it pushes to make chondrocytes stop growing, although not infrequently they bring more details to this process.

Learning about the mechanism of action of proteins such as FGFR3 is like creating a route map highlighting their crossroads, checkpoints, train stations, etc. This mapping allows researchers to work on solutions to overcome lack of or excessive activity of these proteins. Many current therapies for a large number of diseases have been created with the aid of these maps since they help to find the right targets to beat a given medical condition.

Thinking in therapies for achondroplasia, as for other many genetic disorders caused by a single overactive protein, the natural move is to find an agent that could stop that protein to exert its function. Theoretically, this could help reverting or minimizing its effects.

Stopping FGFR3 actions can be achieved through several different approaches (look the "train stations" in the signaling cascade map in Figure 3), from blocking the signal reception by the antenna or blocking the buttons in the control panel to counterbalancing the effect of one of those chemical cascades by stimulating an antagonistic one.

Most of these strategies have been already reviewed here in the blog. For instance, you can block the antenna with antibodies designed to bind it. There are at least three antibodies against FGFR3 published in the literature that have been explored in clinical studies for cancers driven by FGFR3 (see this article).

You can block the buttons on the control panel with small molecules called tyrosine kinase inhibitors (TKIs). There are many TKIs available, but so far none good enough to be used in achondroplasia (see this article). And you can also stimulate another cell antenna (or receptor) to reduce the activity of FGFR3, as we have been witnessing with vosoritide, a C-type natriuretic peptide (CNP) analogue currently in phase 2 clinical trial for achondroplasia.Vosoritide imitates CNP by binding its receptor located at the chondrocyte cell membrane (like FGFR3 is). The receptor is activated and its signaling intercepts MAPK, the FGFR3 main signaling cascade, inhibiting it at the level of the "train station" RAF (Figure 5) (see this article).

Figure 5. CNP signaling cascade intercepts the MAPK cascade triggered by FGFR3.

Matsushita M et al. (2013). PLoS ONE 8(12): e81569. doi:10.1371/journal.pone.0081569. Reproduced here for illustration purposes only
These are only some examples among other several strategies already being explored for achondroplasia (see this article). Nevertheless, there is another kind of approach that would be suitable to control or regulate FGFR3 and, after this long introduction, let’s talk about one of them, which would be targeting the production of FGFR3 (it’s in the title, isn’t it?). In fact, we have already reviewed it here in the blog (listed in the top of the article!, did you read them?), but as new information is coming, I thought it would worth to talk about it again. And finally, it may help get into another new potential strategy that also deals with DNA, RNA and the transcription machinery later.

Regulating the regulator 

As you might know, our DNA is a kind of vault where the chemical information needed to create the proteins fundamental for our body is stored. Life is a dynamic process and there is always the need to produce new proteins so the cells, tissues and the body as a whole can function normally (Animation 1, English, 2:41min)

Animation 1. From DNA to protein (by yourgenome.org).


The way the process by which the DNA is “read” and “copied” to generate proteins often could lead to states where a given gene that encodes the information to generate a protein could be extensively “open” for reading, so the protein could be produced nonstop. This in turn could result in health problems. For example, some kinds of cancer cells, like in breast cancer, are able to start the super production of “antennas” like our FGFR3 to gain advantage of circulating signals that trigger more cancer growth.

In normal conditions, this over production of proteins doesn’t occur because the cell has several quality control measures that work to regulate this process. One of them is comprised by RNA molecules.

But, let’s go slowly here, step by step. I remember in my high school days, when I started to study cell biology, that there were three classical kinds of RNA: the messenger RNA (mRNA), the transfer RNA (tRNA) and the ribosomal RNA (al of them appear in the animation above). Well, since then the list of RNA types has not stopped to grow. Take a look in this Wikipedia page for a list of already identified RNA types. 

Some of these many RNA molecules are involved in the process of controlling the protein production and the focus here is the microRNA, or simply miRNA family (reviewed in those articles mentioned above). These RNA molecules have been shown to control the amount of proteins produced by the cell. Let me invite you to watch the Animation 2 (English, 4:53min) by Katarina Petsche that gives an overall view of miRNA synthesis and how it works:

Animation 2. miRNA synthesis and function (by Katarina Petsche).


Basically, because of their ability of leading mRNAs to degradation, miRNAs have been classified as "gene silencing" molecules. As the target protein is not produced after all, it is as though the gene was not working (or shut down, silenced). 

There are thousands of different miRNAs and each of them is designed to bind to a limited number of mRNAs. There is already a number of miRNAs identified, like miRNA 100 (or miR-100), that bind to the FGFR3 mRNA, but here we have a problem. Although miRNAs are very specific for their targets, there targets are not unique. When you think in "silencing" a specific gene, let's say FGFR3 in achondroplasia, you don't want to silence other target genes, since this could lead to other health problems.

Among the several miRNAs that have been showed to exert a control function over FGFR3, miR-100 seems to be one of the most relevant, since there is mounting evidence that it does control/silence FGFR3. Several recently published studies explored the connection between miR-100 and FGFR3 in pancreatic cancer (7), glioblastoma (8), sarcoma (9) and  in lung cancer cells (10) showed that in those cells overexpressing (over producing) miR-100 there was less FGFR3 available and vice versa and all concluded that miR-100 was able to inhibit cancer growth in their experiments. Don't feel confused about the fact that FGFR3 is used by cancer cells to grow. This happens because FGFR3 is a brake only for growth plate chondrocytes; in other cells it works like an accelerator... These kind of findings may lead to the development of a strategy where miR-100 expression (production) could be stimulated in those cancer cells which use FGFR3 to grow, to silence the FGFR3 gene and beat the tumor.

So, if such an approach could be used for the treatment of cancer, are miR-100 or other miRNAs suitable to treat achondroplasia?

Probably not, because although the evidence exists that they do inhibit FGFR3, there are also other proteins that may be affected by their actions, which could bring undesired problems. In summary, miRNAs are not specific enough.

Well, then, what is the purpose of this review? The thing is that researchers have been able to create, in the lab, another kind of RNA which does basically the same of what miRNAs do (learning a bit about one, is learning about the other, you see...). However, there is a strong difference: it is made by design, and probably will have much more specificity for FGFR3. This synthetic RNA molecule is called small interference RNA or simply siRNA. Studies already made show that siRNAs use the same cell machinery and cause effects like miRNAs (11). Researchers have to introduce the siRNA inside the cell and after that it works like a miRNA. Today, a "simple" approach to prove that a gene is linked to a determined function is to apply a specific siRNA and watch the effects of silencing that gene. For instance, this has been done in several other disease contexts (11), including achondroplasia, in a study by Pintor and Legeai-Mallet (12).

If you read the 2013 article about RNAs you already know that at least one biotech based in US (Marina Biotech) has patented an RNA interference strategy pledging their utility to treat achondroplasia (13). Now, I have found another patent for the use of nucleic acid molecules to treat achondroplasia (14) from Santaris Pharma (Roche), so it looks like there have been some attempts to target FGFR3 in achondroplasia using the siRNA strategy lately. 


We don't know if these approaches will reach clinical development because one of the key challenges for nucleic acid-based therapeutic strategies (RNA is composed by nucleic acids, as you know) is ho
w to make those agents reach their targets. Because RNA molecules are so powerful, the body has a vast number of protective agents to ensure these molecules will not traffic freely for long. RNA is the genetic code of many causing disease viruses, so the body must be ready to get rid of foreigner nucleic acids to defend itself from infections. Therefore, RNA molecules tend to be degraded rapidly by neutralizing enzymes, so this could partially explain why we don't see fast progress in this area. For achondroplasia, the challenge is even greater because the target cells, the chondrocytes, leave in a very well protected environment, the growth plate cartilage, a place tough to reach (see this previous article of the blog).

Delivering the package


Delivery is really challenging, and for this reason I used the verb "to introduce" when I described the use of siRNA just three paragraphs above. It is not easy to make RNA molecules go inside cells, you have to use a taxi (what is called transport, carrier, vector, etc.) or a disguise. For example, several studies applied appendages to the RNA molecule so it became more stable and resistant to neutralizing enzymes. For diseases where the target cell lies in a tissue with direct blood flow, this could be enough to allow the siRNA to enter the cell, but for a tissue such as the growth plate, where there is no direct blood flow, how
can this be achieved?

This is not a trivial question. One possible strategy to deliver a drug to the target is to find something that only that target has (a marker), which is not an easy task, but still feasible. In the case of the growth plate chondrocyte, possibly one of these markers is a cell receptor (another antenna) called CD44. The issue here is that CD44 is expressed by many different cells. So, is it useless? Maybe not, because most of the cells that have CD44 do not express FGFR3 in a significant level, so some influence of a siRNA against FGFR3 on them possibly would not cause any trouble. The idea would be to attach or cover the RNA molecule to another molecule that can bind to CD44. Once connected, the cell system that manage the good shape of the antennas would bring the busy CD44 inside the cell where the siRNA could be released to find its target and exert its expected function. This is just a personal idea, I never found any work exploring this approach in this specific area.

Conclusion

It could sound that this review didn't help much in terms of bringing another new spectacular potential therapy for achondroplasia. It would be more like a general review of the disorder, since the blog already has reviews about miRNAs and siRNAsHowever, we are not wasting time: the processes briefly mentioned here will serve to help us to travel across an even more complex one, which is gene editing, a potential therapeutic strategy that is under the spotlight now.

Could it be used to treat achondroplasia?

From what I have already learned, I would say yes, but let's see in the next article. I am still studying this topic...


References

1.Bellus GA et al. Achondroplasia is defined by recurrent G380R mutations of FGFR3. Am J Hum Genet 1995;56(2):368-73.
Free access.


2.Rousseau F et al. Mutations in the gene encoding fibroblast growth factor receptor-3 in
achondroplasia. Nature 1994;371(6494):252-4.
Free access.


3. Laederich MB and Horton WA. FGFR3 targeting strategies for achondroplasia.Expert Rev Mol Med 2012;14:e11.


4. Narayana J and Horton WA. FGFR3 biology and skeletal disease. Connect Tissue Res 2015;56(6):427-33.


5.
Makrythanasis P et al. A novel homozygous mutation in FGFR3 causes tall stature, severe lateral tibial deviation, scoliosis, hearing impairment, camptodactyly, and arachnodactyly. Hum Mutat 2014;35(8):959-63.

6.
Ornitz DM and Marie PJ. Fibroblast growth factor signaling in skeletal development and disease. Genes Dev. 2015 Jul 15;29(14):1463-86. Free access.7. Li Z et al. MicroRNA-100 regulates pancreatic cancer cells growth and sensitivity to chemotherapy through targeting FGFR3. Tumour Biol 2014;35(12):11751-9.

8. Luan Y et al. Overexpression of miR-100 inhibits cell proliferation, migration, and chemosensitivity in human glioblastoma through FGFR3. Onco Targets Ther 2015;8: 3391-400. Free access.

9. Bi Y et al. Overexpression of miR-100 inhibits growth of osteosarcoma through FGFR3.Tumour Biol 2015;36(11):8405-11.

10. Luo J et al. Overexpression of miR-100 inhibits cancer growth, migration, and chemosensitivity in human NSCLC cells through fibroblast growth factor receptor 3.Tumour Biol 2015; published online Aug 28. DOI 10.1007/s13277-015-3850-z. 


11.Videira M et al. Preclinical development of siRNA therapeutics: towards the match between fundamental science and engineered systems.Nanomedicine 2014;10(4):689-702.
 
12. Guzman-Aránguez A, Legeai‐Mallet L, Pintor J. Fibroblast growth factor receptor 3 inhibition by small interfering RNAs in achondroplasia. Anales Real Acad Nac Farm 2011; 77(1).

13Marina Biotech Patent WO 2011139842 A2. Nucleic acid compounds for inhibiting fgfr3 gene expression and uses thereof. 


14. Santaris Pharma WO 2014080004 A1. Compositions and methods for modulation of fgfr3 expression.