segunda-feira, 24 de março de 2014

Tratando la acondroplasia: NC-2, un nuevo análogo del CNP

Traducción: Maria Cristina Terceros

Introducción

Muchos temas que revisamos aquí son bastante técnicos. Para hacerlos más accesibles a más lectores (bueno, espero que algún día hayan más que diecisiete), tengo la costumbre de presentar el tema en partes, para así darle una base apropiada y, en seguida, ir al tema principal de aquel artículo en particular. En éste, pensé que sería bueno volver a uno de los mecanismos más importantes por los cuales el receptor del factor de crecimiento de fibroblasto tipo 3 (FGFR3) utiliza para ejercer sus efectos en la placa de crecimiento, cascada enzimática de la proteína quinasa activada por mitógeno (MAPK).

Un aspecto relevante de las moléculas como el NC- 2 es su tamaño y, como ésta es una propiedad fundamental para cualquier tratamiento en potencial que intenta alcanzar a los condrocitos en la placa de crecimiento, también vamos a visitar nuevamente y brevemente la placa de crecimiento.

Las RASopatías

Las RASopatías son una familia de enfermedades genéticas que comparten una característica común: todas ellas son causadas por disturbios en la vía de señalización de la MAPK, asociados a mutaciones en las proteínas de esta cascada de señalización o en proteínas que regulan su actividad (Figura 1). Cualquiera que sea la localización de la mutación, esto lleva a la excesiva señalización de la MAPK, lo que a su vez es la causa de los diferentes aspectos clínicos de los variados síndromes asociados (1).

Figura 1. 

Un boceto de la vía de señalización RAS- MAKP. Síndromes causados por mutaciones en los genes que controlan la producción de determinadas proteínas de señalización. De Socialstyrelsen.se.
Para más informaciones sobre la vía MAPK, lea el último artículo publicado en el blog. El blog también posee una serie de artículos anteriores que se refieren a la cascada de la MAPK, accesibles a través de la página del índice de su idioma de preferencia (link (enlace) localizado en la parte superior de esta página).

La señalización de la MAPK reduce el crecimiento óseo

Una característica común de los individuos con RASopatías es la baja estatura. Como la MAPK es fundamental para el desarrollo de la placa de crecimiento (2), es razonable pensar que la actividad excesiva de la MAPK encontrada en las RASopatías también influye en los condrocitos de la placa de crecimiento de los individuos afectados. Sin embargo, existe poca información específica sobre las consecuencias de la excesiva señalización de la MAPK en los huesos, en el contexto de este grupo de enfermedades.

Es por eso que, con el objetivo de entender el mecanismo de la baja estatura en una de las RASopatías, la neurofibromatosis tipo 1, el mes de abril de 2013, el grupo del Dr. Florent Elefteriou publicó un elegante estudio donde ellos exploraron los papeles de la vía MAPK en los condrocitos de la placa de crecimiento en un modelo animal donde ellos “desenchufaron” la neurofibromina en esas células (3).

En aquel tempo, revisamos ese estudio en otro artículo, pero estoy retornando a él para hablar más sobre el NC- 2, el análogo del péptido natriurético tipo C (CNP) usado en ese trabajo. Después de buscar durante un bien tiempo, finalmente encontré la patente con la descripción del NC- 2 y los diferentes resultados de los tests ya realizados con este compuesto. La patente indica que podría ser utilizado para tratar la acondroplasia (4).

Aparte de eso, el NC - 2 parece estar ahora bajo desarrollo y producción a través de Alexion, una conocida empresa de biotecnología, lo que aumenta la probabilidad de que podría progresar hacia estudios clínicos. Sin embargo, antes de hablar sobre la patente, vamos a comenzar con lo básico, hablando un poco sobre el estudio realizado por Ono et al., la neurofibromina, el FGFR3 y el CNP.

La neurofibromina y el CNP en la placa de crecimiento

La neurofibromina funciona a través de la inactivación de la proteína RAS en lo alto de la cascada de MAPK (Figura 2). Ono et al., desarrollaron un modelo de ratón, en el cual la neurofibromina estaba ausente en las placas de crecimiento. Los animales afectados presentaron padrón semejante al que se encuentra en las displasias relacionadas con el FGFR3, incluyendo los huesos cortos y las placas de crecimiento más estrechas, con las zonas proliferativa e hipertrófica más pequeñas. La ausencia de la neurofibromina permitió que la enzima RAS permaneciese activa por más tempo, manteniendo así toda la MAPK más activa que lo normal, en un mecanismo parecido con el que se da en la acondroplasia.

Figura 2. Interacciones entre las enzimas receptoras, la vía RAS-MAPK y la neurofibromina

La función de la neurofibromina en la vía RAS-MAPK. La unión, (El enlace) de factores de crecimiento con enzimas receptoras (RTK) da como resulta una dimerización y una auto-fosforilación. La Grb2, una proteína adaptadora, se une al receptor, y forma un complejo con la SOS, estimulando el intercambio de GDP para GTP en la RAS. La neurofibromina posee actividad RAS-GTPasa e inactiva la RAS. La RAS unida a la GTP activa la RAF, conduciendo hacia la fosforilación y la activación de la MEK y de la ERK, una quinasa regulada por medio de señal extracelular que puede entrar en el núcleo y fosforilar factores de transcripción. La RAS también activa la PI3K, la AKT y la mTOR. RTKs = tirosina quinasa receptora. P = fosforilación. Grb2 = proteína asociada al receptor del factor de crecimiento 2. SOS = homólogo mamífero del Son of Sevenless de la Drosophila RAS = homólogo del oncogén viral del sarcoma del ratón. GD = difosfato de guanosina. GTP = trifosfato de guanosina. RAF = homólogo del oncogén viral del sarcoma murino. MEK = MAPK-ERK quinasa. PI3K = fosfatidilinositol-3-quinase. AKT= V-Akt homólogo del oncogén viral del timoma murino 1. mTOR = diana de la rapamicina en mamíferos.NA: En el contexto de los condrocitos, piensa en factores de crecimiento como ser los FGF y la RTK como el FGFR3. De: H Brems et al. Lancet Oncol 2009; 10(5):508-15. Aviso: esta figura se encuentra disponible gratuitamente a través de Google Images y fue reproducida aquí apenas con fines de información.

NC- 2 rescata el retardo de crecimiento causado debido a la ausencia de neurofibromina

Ono et al., administraron NC-2 a animales con condrocitos sin neurofibromina y verificaron que este análogo del CNP fue capaz de rescatar el crecimiento de esas células en los animales expuestos, compensando los efectos de la falta de neurofibromina. Un mérito de este estudio es que él demostró claramente el tipo de consecuencias que defectos en la neurofibromina pueden causar a la placa de crecimiento y también conocimiento para generar nuevas estrategias terapéuticas para tratar as RASopatías e las displasias relacionadas con el FGFR3. Piense en una molécula que pudiese interactuar con la RAS, de la misma forma en que lo hace la neurofibromina...

CNP en condrocitos

Los investigadores descubrieron que la señalización del CNP actúa directamente en la proteína RAF de la cascada MAPK, reduciendo su actividad. Como la MAPK es considerada un factor-clave de la señalización del FGFR3 en condrocitos, se entiende que el CNP es un modulador de ese receptor. (Figura 3). (5) En otras palabras, mientras el FGFR3 influye negativamente en el crecimiento del hueso, el CNP tiene un efecto positivo.

Figura 3. Interacción de las vías del FGFR3 y del CNP


NC-2, un nuevo análogo del CNP

En el estudio realizado por Ono y colaboradores, se describe al NC-2 como una molécula formada por la fusión de una forma activa del CNP, llamada CNP 22, con la parte Fc de una inmunoglobulina (anticuerpo). Vamos a detenernos aquí para explicar brevemente qué es el fragmento Fc de un anticuerpo.

Las inmunoglobulinas son proteínas creadas por el sistema de defensa del cuerpo (el sistema inmunológico) para combatir moléculas o formas de vida extrañas al cuerpo (virus etc.). Básicamente, ellas están compuestas de dos partes: a) la parte Fc es común a todas las inmunoglobulinas, como una especie de base, y b) la parte Fab, la cual es montada por las células del sistema inmune, específicamente para atacar un determinado objetivo (Figura 4). Ambas partes están integradas para convertirse en un anticuerpo activo. Es possible unir la parte Fc de un anticuerpo a otras moléculas para aumentar su media de vida, capacidad de transporte y direccionamiento hacia el objetivo o diana. Hay varios ejemplos disponibles, como ser una molécula que funde el fragmento Fc al interferón (6).

Figura 4. Una representación simple de una inmunoglobulina


De acuerdo con la literatura, los fragmentos Fc generalmente tienen un peso molecular de aproximadamente 50 kilodaltons (kDa). Este tamaño puede representar un problema para el NC-2, dentro del contexto de la placa de crecimiento. Vamos a ver porqué.

El cartílago de la placa de crecimiento como una barrera

La placa de crecimiento es un tejido denso, también llamado matriz extracelular, donde los condrocitos se encuentran rodeados de proteínas de la familia del colágeno y de otras grandes moléculas. La matriz no es solamente densa, sino que también se encuentra eléctricamente cargada y no recibe flujo de sangre directo de manera uniforme. Estás características funcionan como barreras químicas y físicas al tráfico para grandes moléculas. Esto es probablemente como un mecanismo de defensa evolutivo bastante antiguo en el organismo en crecimiento: el núcleo de la máquina de crecimiento del hueso tuvo que estar bastante bien protegido contra invasores, bajo el riesgo de que el programa de crecimiento fuera perturbado. Por otro lado, la reducción de la entrada de una parte de los agentes del cuerpo pudo también contribuir a modular la tasa de crecimiento. La mayoría de los agentes del cuerpo con funciones de desarrollo son agentes positivos para el crecimiento, como las hormonas de la hipófisis.

Algunos investigadores estudiaron cómo se da el tráfico de moléculas en el interior de la placa de crecimiento, y demostraron que es probable que moléculas con 40 kDa o menos tendrían paso libre hacia el interior del cartílago (7,8).

Estos hallazgos podrían explicar porque el PRO-001, el primer anticuerpo anti-FGFR3 específico nunca progresó hacia su desarrollo clínico para la acondroplasia. El PRO-001 fue desarrollado por el grupo del Dr. Avner Yayon (9) hace más de una década, y mostró resultados promisorios en sus primeros ensayos, pero podemos creer que no tuvo un buen final debido a su gran tamaño: un anticuerpo normal pesa aproximadamente 150 kDa.

Por otro lado, vimos anteriormente, que la placa de crecimiento siempre fue descrita como un ambiente avascular (sin circulación sanguínea), pero existen evidencias de que este concepto pueda ser apenas parcialmente correcto (10).

Aparte de eso, viendo las propiedades naturales de la placa de crecimiento, ¿cómo podremos interpretar los resultados a partir del estudio realizado por Ono et aL., y por el grupo del Dr. Gouze (11), recientemente comentado aquí? En ambos casos, las moléculas pesan más que el límite de 40 kDa, y aun así, ejercieron los efectos esperados en la placa de crecimiento.

Se puede especular que, en estos casos, los investigadores, hayan realizado estudios usando ciertas dosis de sus compuestos para obtener los resultados deseados, y que serían demasiado altas para ser usadas con seguridad en pacientes humanos. Sin embargo, conforme a lo informado por el grupo del Dr. Gouze, fueron realizados pruebas toxicológicas en los animales expuestos y nada preocupantes fue encontrado (11).

Parece que todavía tenemos bastante para aprender sobre las propiedades de la placa de crecimiento.

Conclusión

El NC-2 es una molécula muy interesante. No sabemos si hoy aún está siendo evaluada como potencial candidato para el desarrollo clínico por Alexion. Como es poco frecuente que una empresa que esté desarrollando una nueva droga comparta un fuerte candidato a desarrollo clínico con investigadores externos que trabajan de manera independiente, el hecho de que el NC-2 haya sido usado de esta manera puede implicar que este análogo del CNP podría haber sido abandonado. Aún si éste fuera el caso, el concepto todavía es atractivo y muestra cómo los investigadores pueden ser creativos en la búsqueda de soluciones inteligentes para combatir condiciones clínicas con claras necesidades médicas no atendidas. Si alguien se encuentra interesado en saber más sobre el CNP y sobre la placa de crecimiento, puede visitar los artículos anteriores del blog:
Referencias

1.Tidyman WE and Rauen KA. The RASopathies: Developmental syndromes of Ras/MAPK pathway dysregulation. Curr Opin Genet Dev 2009; 19(3): 230–36. Acceso libre.

2. Foldynova-Trantirkova S et al. Sixteen years and counting: the current understanding of fibroblast growth factor receptor 3 (FGFR3) signaling in skeletal dysplasias. Hum Mutat 2012; 33:29–41. Acceso libre.

3. Ono K et al. The ras-GTPase activity of neurofibromin restrains ERK-dependent FGFR signaling during endochondral bone formation. Hum Mol Genet 2013;22(15):3048-62.

4. Alexion Pharma International. Compositions comprising natriuretic peptides and methods of use thereof. Patent US 20120164142 A1. Jun, 28th 2012. Acceso libre.

5. Krejci P et al. Interaction of fibroblast growth factor and C-natriuretic peptide signaling in regulation of chondrocyte proliferation and extracellular matrix homeostasis. J Cell Sci 2006; 118: 5089-00. Acceso libre.

6. Jones TD et al. The development of a modified human IFN-alpha2b linked to the Fc portion of human IgG1 as a novel potential therapeutic for the treatment of hepatitis C virus infection. J Interferon Cytokine Res 2004;24(9):560-72.

7. Farnum CE et al. In vivo delivery of fluoresceinated dextrans to the murine growth plate: imaging of three vascular routes by multiphoton microscopy. Anat Rec A Discov Mol Cell Evol Biol 2006;288(1):91-103. Acceso libre.

8. Williams RM et al. Solute transport in growth plate cartilage: in vitro and in vivo.
Biophys J 2007;93(3):1039-50. Acceso libre.

9. Aviezer D et al. Fibroblast growth factor receptor-3 as a therapeutic target for Achondroplasia--genetic short limbed dwarfism. Curr Drug Targets 2003;4(5):353-65.

10. Wirth T et al. The blood supply of the growth plate and the epiphysis: a comparative scanning electron microscopy and histological experimental study in growing sheep. Calcif Tissue Int 2002;70(4):312-9.

11. Garcia S et al. Postnatal soluble FGFR3 therapy rescues achondroplasia symptoms and restores bone growth in mice. Sci Transl Med 2013;5:203ra124.

sábado, 15 de março de 2014

Tratando a acondroplasia: NC-2, um novo análogo do CNP

Introdução

Muitos temas que revemos aqui são bastante técnicos. Para torná-los mais acessíveis a mais leitores (bom, espero que algum dia haverá mais que dezessete), costumo introduzir o tema em partes, para dar uma base apropriada e, em seguida, ir ao assunto principal daquele artigo em particular. Neste, pensei que seria bom retornar a um dos mecanismos mais importantes pelos quais o receptor do fator de crescimento de fibroblastos 3 (FGFR3) utiliza para exercer seus efeitos na placa de crescimento,
cascata enzimática da proteína quinase ativada por mitógeno (MAPK).

Um aspecto relevante de moléculas como o NC- 2 é o seu tamanho e, como esta é uma propriedade fundamental para qualquer tratamento potencial que vise alcançar os condrócitos na placa de crescimento, vamos também revisitar brevemente a placa de crescimento.


As RASopatias

As RASopatias são uma família de doenças genéticas que compartilham uma característica comum: todas elas são causadas ​​por distúrbios
na via de sinalização da MAPK, associados a mutações nas proteínas desta cascata de sinalização ou em proteínas que regulam a sua atividade (Figura 1). Qualquer que seja a localização da mutação, isto conduz à excessiva sinalização da MAPK, o que por sua vez é a causa dos diferentes aspectos clínicos das várias síndromes associadas.(1)

Figura 1. 
Um esboço da via de sinalização RAS- MAKP. Síndromes causadas por mutações nos genes que controlam a produção de certas proteínas de sinalização. De Socialstyrelsen.se.

Para mais informações sobre a via MAPK, leia o último artigo publicado no blog. O blog também tem uma série de artigos anteriores falando sobre a cascata da MAPK, acessíveis através da página de índice do seu idioma preferencial (link localizado no topo desta página).

A sinalização da MAPK reduz o crescimento ósseo

Uma característica comum dos indivíduos com RASopatias é a baixa estatura. Como a MAPK é fundamental para o desenvolvimento da placa de crescimento (2), é razoável pensar que a atividade excessiva da MAPK encontrada nas RASopatias também influencia os condrócitos na placa de crescimento dos indivíduos afetados. No entanto, há pouca informação específica sobre as consequências da sinalização excessiva
da MAPK nos ossos, no contexto deste grupo de doenças.

É por isso que, com o objetivo de entender o mecanismo da baixa estatura em uma dos RASopatias, a neurofibromatose tipo 1, em abril de 2013 o grupo do Dr. Florent Elefteriou publicou um
elegante estudo em que eles exploraram os papéis da via MAPK nos condrócitos da placa de crescimento em um modelo animal onde eles "desligaram" a neurofibromina nessas células.(3)

Na época, revimos esse estudo em um outro artigo, mas estou retornando a ele para falar mais sobre o NC- 2, o análogo do peptídeo natriurético tipo C (CNP) usado nesse trabalho. Depois de buscar por um bom tempo, finalmente encontrei a patente com a descrição do NC- 2 e os muitos resultados dos testes já realizados com este composto. A patente indica que o NC-2 poderia ser utilizado para tratar a acondroplasia.(4)


Além disso, o NC - 2 parece estar agora sob desenvolvimento pela Alexion, uma conhecida empresa de biotecnologia, o que aumenta a probabilidade de que poderia progredir para estudos clínicos. No entanto, antes de falar sobre a patente, vamos começar do básico, falando um pouco sobre o estudo realizado por Ono et al., a neurofibromina, o FGFR3 e o CNP.

A neurofibromina e o CNP na placa de crescimento

A neurofibromina funciona através da inativação da proteína RAS no topo da cascata de MAPK (Figura 2). Ono et al. desenvolveram um modelo de camundongo no qual a neurofibromina estava ausente nas placas de crescimento. Os animais afetados apresentaram padrão semelhante ao que é encontrado em displasias relacionadas com o FGFR3, incluindo os ossos curtos e placas de crescimento mais estreitas, com as zonas proliferativa e hipertrófica menores. A ausência da neurofibromina permitiu que a enzima RAS ficasse mais tempo ativa, mantendo assim toda a MAPK mais ativa do que o normal, em um mecanismo parecido com o que acontece na acondroplasia.

Figura 2 .
Interações entre as enzimas receptoras, a via RAS-MAPK e a neurofibromina

A função de neurofibromina na via RAS-MAPK. A ligação de fatores de crescimento com enzimas receptoras (RTK) resulta em dimerização e auto-fosforilação. A Grb2, uma proteína adaptadora, se liga ao receptor, e forma um complexo com a SOS, estimulando a troca de GDP para GTP na RAS. A neurofibromina tem atividade RAS-GTPase e inativa a RAS. A RAS ligada a GTP ativa a RAF, levando a fosforilação e ativação da MEK e da ERK, uma quinase regulada por sinal extracelular que pode entrar no núcleo e fosforilar fatores de transcrição. A RAS também ativa a PI3K, a AKT e a mTOR. RTKs = tirosina quinase receptora. P = fosforilação. Grb2 = proteína associada a receptor de fator de crescimento 2. SOS = homólogo  mamífero do Son of Sevenless da Drosophila . RAS = homológo do oncogene viral do sarcoma do rato. GD = difosfato de guanosina. GTP = trifosfato de guanosina. RAF = homólogo do oncogene viral do sarcoma murino. MEK = MAPK-ERK quinase. PI3K = fosfatidilinositol-3-quinase. AKT= V-Akt homólogo do oncogene viral do timoma murino 1. mTOR = alvo da rapamicina em mamíferos.NA: No contexto dos condrócitos, pense em fatores de crescimento como os FGF e a RTK como o FGFR3. De: H Brems et al. Lancet Oncol 2009; 10(5):508-15. Aviso: esta figura está disponível gratuitamente através do Google Images e foi reproduzida aqui apenas para fim de informação.
NC- 2 resgata o retardo de crescimento causado pela ausência de neurofibromina

Ono et al. administraram NC-2 a animais com
condrócitos sem neurofibromina e verificaram que este análogo do CNP foi capaz de resgatar o crescimento dessas células nos animais expostos, compensando os efeitos da falta de neurofibromina. Um mérito deste estudo é que ele demonstrou claramente o tipo de consequências que defeitos na neurofibromina podem causar à placa de crescimento e também conhecimento para gerar novas estratégias terapêuticas para tratar as RASopatias e as displasias relacionadas com o FGFR3. Pense em uma molécula que pudesse interagir com a RAS, da mesma forma que a neurofibromina faz ...

CNP em condrócitos

Os pesquisadores descobriram que a sinalização do CNP atua diretamente na proteína RAF da cascata MAPK, reduzindo sua atividade. Como a MAPK é considerada um fator-chave da sinalização do FGFR3 em condrócitos, entende-se que o CNP é um modulador desse receptor. (Figura 3).(5) Em outras palavras, enquanto o FGFR3 influencia negativamente o crescimento do osso, o CNP tem um efeito positivo.

Figura 3 . Interação das vias do FGFR3 e do CNP



NC-2, um novo análogo do CNP

No estudo realizado por Ono e colaboradores, o NC-2 é descrito como uma molécula formada pela fusão de uma forma ativa do CNP, chamada CNP 22, com a parte Fc de uma imunoglobulina (anticorpo). Vamos fazer uma parada aqui para explicar brevemente o que é o fragmento Fc de um anticorpo.

As imunoglobulinas são proteínas criadas pelo sistema de defesa do corpo (o sistema imunológico) para combater moléculas
ou formas de vida estranhas ao corpo (vírus etc.). Basicamente, elas são compostas de duas partes: a) a parte Fc é comum a todas as imunoglobulinas, como uma espécie de base, e b) a parte Fab, a qual é montada pelas células do sistema imune especificamente para atacar um determinado alvo (Figura 4). Ambas as partes são integradas para se tornarem um anticorpo ativo. A parte Fc de um anticorpo pode ser ligada a outras moléculas para aumentar a sua meia-vida, capacidade de transporte e direcionamento ao alvo. Existem vários exemplos disponíveis, tais como uma molécula que funde o fragmento Fc ao interferon.(6)

Figura 4 . Uma simples representação de uma imunoglobulina



De acordo com a literatura, os fragmentos Fc geralmente têm um peso molecular de cerca de 50 quilodaltons (kDa). Este tamanho pode representar um problema para o NC-2, no contexto da placa de crescimento. Vamos ver o porquê.

A
cartilagem da placa de crescimento como uma barreira

A placa de crescimento é um tecido denso, também chamado de matriz extracelular, onde os condrócitos são rodeados por proteínas da família do colágeno e de outras moléculas grandes. A matriz não só é densa, mas também carregada eletricamente e não recebe fluxo de sangue direto de maneira uniforme. Essas características funcionam como barreiras químicas e físicas a
o tráfego para grandes moléculas. Isto é provavelmente como um mecanismo de defesa evolutivo muito antigo no organismo em crescimento: o núcleo da máquina de crescimento do osso teve de ser muito bem protegido contra invasores, sob o risco de o programa do crescimento ser perturbado. Por outro lado, a redução da entrada de uma parte dos agentes de corpo pode também contribuir para modular a taxa de crescimento. A maioria dos agentes do corpo com funções de desenvolvimento são agentes positivos para o crescimento, como os hormônios da hipófise.

Alguns investigadores estudaram como é o tráfego de moléculas no interior da placa de crescimento e demostraram que é provável que moléculas com 40 kDa ou menos teriam passagem livre no interior da cartilagem.(7,8)

Esses achados poderiam explicar porque o PRO-001, o primeiro anticorpo anti-FGFR3 específico nunca progrediu para o desenvolvimento clínico para a acondroplasia. O PRO-001 foi desenvolvido pelo grupo do Dr. Avner Yayon (9) mais de uma década atrás, e mostrou resultados promissores nos primeiros testes, mas podemos presumir que não foi bem sucedido devido a seu grande tamanho: um anticorpo típico pesa cerca de 150 kDa.

Por outro lado, vimos acima que a placa de crescimento foi sempre descrita como um ambiente avascular (sem circulação de sangue), mas há evidências de que este conceito pode ser apenas parcialmente correto.(10)

Além disso, tendo em vista as propriedades naturais da placa de crescimento, como podemos interpretar os resultados a partir do estudo por Ono et aL. e os do grupo do Dr. Gouze (11), recentemente comentado aqui ? Em ambos os casos, as moléculas pesam mais do que o limite de 40 kDa, e ainda assim, exerceram os efeitos esperados na placa de crescimento.

Pode-se especular que, nestes casos, os investigadores realizaram os testes utilizando certas doses de seus compostos para obter os resultados desejados, e que seriam demasiado altas para ser usadas com segurança em pacientes humanos. No entanto , conforme informado pelo grupo do Dr. Gouze, testes toxicológicos foram realizados nos animais expostos e nada de preocupante foi encontrado.(11)

Parece que ainda temos de aprender mais sobre as propriedades da placa de crescimento.

Conclusão

O NC-2 é uma molécula muito interessante. Não sabemos hoje se ele ainda está sendo avaliada como um candidato em potencial para o desenvolvimento clínico pela Alexion. Como é incomum que uma empresa que está desenvolvendo uma nova droga compartilhe um forte candidato a desenvolvimento clínico com pesquisadores externos que trabalham de forma independente, o fato do NC-2 ter sido usado assim pode implicar que este análogo do CNP poderia ter sido abandonado. Mesmo se for este o caso, o conceito ainda é atraente e mostra como os pesquisadores podem ser criativos à procura de soluções inteligentes para combater condições clínicas com claras necessidades médicas não atendidas.

Se você estiver interessado em saber mais sobre CNP e a placa de crescimento, basta visitar estes artigos anteriores do blog:


A última fortaleza: a cartilagem da placa de crescimento


Referências

1.Tidyman WE and Rauen KA. The RASopathies: Developmental syndromes of Ras/MAPK pathway dysregulation. Curr Opin Genet Dev 2009; 19(3): 230–36. Acesso livre.
 
2. Foldynova-Trantirkova S et al. Sixteen years and counting: the current understanding of fibroblast growth factor receptor 3 (FGFR3) signaling in skeletal dysplasias. Hum Mutat 2012; 33:29–41.
Acesso livre.
 
3. Ono K et al. The ras-GTPase activity of neurofibromin restrains ERK-dependent FGFR signaling during endochondral bone formation. Hum Mol Genet 2013;22(15):3048-62.
 

4. Alexion Pharma International. Compositions comprising natriuretic peptides and methods of use thereof. Patent US 20120164142 A1. Jun, 28th 2012.  Acesso livre.

5. Krejci P et al. Interaction of fibroblast growth factor and C-natriuretic peptide signaling in regulation of chondrocyte proliferation and extracellular matrix homeostasis. J Cell Sci 2006; 118: 5089-00.
Acesso livre.
 
6. Jones TD et al. The development of a modified human IFN-alpha2b linked to the Fc portion of human IgG1 as a novel potential therapeutic for the treatment of hepatitis C virus infection. J Interferon Cytokine Res 2004;24(9):560-72.
 
7. Farnum CE et al. In vivo delivery of fluoresceinated dextrans to the murine growth plate: imaging of three vascular routes by multiphoton microscopy. Anat Rec A Discov Mol Cell Evol Biol 2006;288(1):91-103. Acesso livre.

8. Williams RM et al. Solute transport in growth plate cartilage: in vitro and in vivo.
Biophys J 2007;93(3):1039-50. Acesso livre.
 
9. Aviezer D et al. Fibroblast growth factor receptor-3 as a therapeutic target for Achondroplasia--genetic short limbed dwarfism. Curr Drug Targets 2003;4(5):353-65. 
 
10. Wirth T et al. The blood supply of the growth plate and the epiphysis: a comparative scanning electron microscopy and histological experimental study in growing sheep. Calcif Tissue Int 2002;70(4):312-9.
 
11. Garcia S et al. Postnatal soluble FGFR3 therapy rescues achondroplasia symptoms and restores bone growth in mice. Sci Transl Med 2013;5:203ra124.



sexta-feira, 7 de março de 2014

Treating achondroplasia: NC-2, a new CNP analogue

Introduction


Many topics we review here are very technical. To make them easier for more readers (you see, I hope some day will be more than seventeen) I usually introduce the theme in parts, aiming to give an appropriate background to then go to the main subject for the particular article. In this one, I found it would be good to increase our view of one of the most important way the fibroblast growth factor receptor 3 (FGFR3) uses to exert its effects in the growth plate, the mitogen-activated protein kinase (MAPK) enzymatic cascade.

A relevant aspect of molecules like NC-2 is their size and as this is a key property for any potential therapy aiming to reach the chondrocytes in the growth plate, we will be also briefly revisiting the growth plate.


The Rasopathies

The Rasopathies are a family of genetic disorders that share a common feature: all of them are caused by disturbances in the mitogen activated protein kinase (MAPK) signaling pathway, associated to mutations in proteins of this signaling cascade or in proteins that regulate its activity (Figure 1). No matter where the mutation is located, it leads to excessive MAPK signaling, which in turn is the cause of the different clinical aspects found in the several associated syndromes. (1)

An outline of the RAS-MAKP signalling pathway. Syndromes caused by mutations in the genes which control the production of certain signal proteins. From Socialstyrelsen.se.
For more information about the MAPK pathway, read the last article published in the blog. The blog also has a number of previous articles talking about the MAPK cascade, accessible through your preferential language index page (link located on the top of this page). 

MAPK signaling impairs bone growth

A common feature that individuals with RASopathies share is short stature. Since that the MAPK pathway is key in the growth plate development (2), it is reasonable to think that the excessive MAPK activity found in RASopathies is also influencing chondrocytes in the growth plate of affected individuals. However, there is little specific information about the consequences of MAPK excessive signaling in the context of this group of disorders.

That's why, aiming to understand the mechanism of short stature in one of the RASopathies, neurofibromatosis type 1, on April 2013 the group of Dr. Florent Elefteriou published an elegant and insightful study in which they explored the roles of the MAPK pathway in growth plate chondrocytes in an animal model where they could turn off neurofibromin in those cells. (3)

We have already reviewed their study at that time in a previous article, but I am returning to it to talk more about NC-2, the C-type natriuretic peptide (CNP) analogue used in their work. After looking for it for some time, I finally found the patent describing NC-2 and the many results of the tests already done with this compound. The patent claims that NC-2 could be used to treat achondroplasia.(4) Furthermore, NC-2 seems to be now under development by Alexion, a known biotech, which increases the chance that it could progress to clinical studies. However, before going to the patent, let's start from the basics, talking a bit about the study by Ono et al., neurofibromin, FGFR3 and CNP.

Neurofibromin and CNP in the growth plate

Neurofibromin works by inactivating the protein RAS in the top of the MAPK cascade (Figure 2). Ono et al. developed a mouse model where neurofibromin was absent in growth plates. The affected animals had patterns similar to what is found in FGFR3-related dysplasias, including short bones and shorter growth plates, with reduced proliferative and hypertrophic zones. The absence of neurofibromin made RAS staying active more time, thus keeping MAPK more active than normal, in a mechanism resembling what happens in achondroplasia.

Figure 2. Receptor enzymes-RAS-MAPK pathway and neurofibromin interactions


The function of neurofibromin in the RAS–MAPK pathway
Binding of growth factors to RTKs results in dimerisation and auto-phosphorylation. Grb2, an adaptor protein, binds to the receptor and forms a complex with SOS, stimulating GDP/GTP exchange on RAS. Neurofibromin has RAS-GTPase activity and inactivates RAS. GTP-bound RAS activates RAF, leading to phosphorylation and activation of MEK and then ERK: an extracellular signal regulated kinase that can enter the nucleus and phosphorylate transcription factors. RAS also activates PI3K, AKT, and mTOR. RTKs=receptor tyrosin kinases. P=phosphorylation. Grb2=growth factor receptor bound 2. SOS=mammalian homolog of the Drosophila son of sevenless. RAS=rat sarcoma viral oncogene homologue. GDP=guanosine diphosphate. GTP=guanosine triphosphate. RAF=murine sarcoma viral oncogene homologue. MEK=MAPK-ERK kinase. PI3K=phosphatidylinositol-3–kinase. AKT=V-akt murine thymoma viral oncogene homologue 1. mTOR=mammalian target of rapamycin.
From: Brems H et al. Lancet Oncol 2009;10 (5):508-15. N.A.: In the context of the chondrocyte, think on growth factors as FGFs and RTK as FGFR3. Disclosure: figure freely available through Google Images, reproduced here for information purposes only.
NC-2 rescues the growth impairment caused by the absence of neurofibromin

Ono et al. gave NC-2 to mice with no neurofibromin in chondrocytes and found that this CNP analogue was capable to rescue the cell growth in the exposed animals, counteracting the effects of the loss of neurofibromin. One merit of this study is that it could solidly demonstrate the kind of consequences defects in neurofibromin can cause to the growth plate and also brought insights for novel therapeutic strategies to treat the RASopathies and FGFR3-related dysplasias. Think about a molecule that could interact with RAS in the same way neurofibromin does...

CNP in chondrocytes

Researchers have learned that CNP signaling works directly on the protein RAF of the MAPK cascade, reducing the activity of MAPK. Since MAPK is considered a key driver of FGFR3 signaling in chondrocytes, CNP is thought to be a modulator of this receptor. (Figure 3). (5) In other words, while FGFR3 negatively influence bone growth, CNP has a positive effect.

Figure 3. FGFR3 and CNP pathway interaction



NC-2, another CNP analogue


In the study by Ono and coworkers, NC-2 is described as a molecule made by the fusion of an active form of CNP, called CNP 22, with the Fc part of an immunoglobulin (antibody). Let's make a stop here to briefly explain what is the Fc fragment of an antibody.

Immunoglobulins are proteins created by the body defense system (immune system) to beat foreign molecules or life forms (virus, etc.). Basically, they are composed by two parts: a) the Fc part is common to all immunoglobulins, like a scaffold; and b) the Fab part, which is tailored by the cells of the immune system to attack a specific target (Figure 4). Both parts are integrated to become an active antibody. The Fc part of an antibody can be linked to other molecules to increase their half-life, transport and targeting capability. There are several examples available, such as a molecule that fuse the Fc fragment with interferon. (6)

Figure 4. Very simple representation of an immunoglobulin




The Fc fragments usually have a molecular weight of around 50 kiloDaltons (kDa), according to the books. This size could represent a problem for NC-2, in the context of the growth plate. Let's see why.

The cartilage growth plate as a barrier

The growth plate is a dense tissue, also called extracellular matrix, where chondrocytes are surrounded by proteins of the collagen family and other large molecules. The matrix not only is dense but also electrically charged and does not receive direct blood flow uniformly. All of these features work as chemical and physical barriers for large molecules to traffic inside it. This probably serves as a very ancient evolutionary defense mechanism in the growing organism: the core of the bone growth machinery had to be very well protected against invaders under the risk of having the growth program disturbed. By the other side, reducing the entry of part of the body agents might have also contributed to modulate the growth rate. Most of the body agents with developmental roles are positive agents for growth.

Some researchers studied how the traffic of molecules within the growth plate is and they showed that it is unlikely that molecules with 40 kDa or more would have free pass within the cartilage. (7, 8) 

This finding may explain why PRO-001, the first specific anti-FGFR3 antibody never progressed to clinical development for achondroplasia. PRO-001 was developed by Dr. Avner Yayon's group (9) more than a decade ago and showed promising results in the first tests, but we presume it wasn't successful due to its large size: a typical antibody will have around 150 kDa. 

On the other hand, we saw above that the growth plate has always been described as an avascular environment, but there is evidence that this concept might be only partially correct.(10)  

Furthermore, in view of the natural properties of the growth plate, how can we interpret the results from the study by Ono et al. and those from the Dr Gouze's group (11), recently reviewed here? In both cases, the molecules weigh more than that threshold of 40 kDa, yet they exerted the expected effects in the growth plate. 

One could speculate that in these cases the researchers performed their tests using doses of their compounds to obtain the desired outcomes that would be too high to be proportionally used in human patients safely. However, as informed by the Dr Gouze's group, toxicological tests were perfomed in the exposed animals and nothing of concern was found. (11)

It looks like that we still need to learn more about the growth plate properties.

Conclusion

NC-2 is a very interesting molecule. We do not know today if it is still being evaluated as a potential candidate for clinical development by Alexion. Since it is not common that a drug developer share a strong clinical development candidate for external researchers working independently, the fact that NC-2 has been used in such a way may imply that this analogue might have been retired. Even if this is the case, the concept is still compelling and shows how researchers can be creative looking for smart solutions to tackle clinical conditions with clear medical needs.


If you are interested in knowing more about CNP and the growth plate just visit these previous blog's articles:


 The last stronghold: the growth plate cartilage


References


1.Tidyman WE and Rauen KA. The RASopathies: Developmental syndromes of Ras/MAPK pathway dysregulation. Curr Opin Genet Dev 2009; 19(3): 230–36. Free access.

2. Foldynova-Trantirkova S et al. Sixteen years and counting: the current understanding of fibroblast growth factor receptor 3 (FGFR3) signaling in skeletal dysplasias. Hum Mutat 2012; 33:29–41. Free access.

3. Ono K et al. The ras-GTPase activity of neurofibromin restrains ERK-dependent FGFR signaling during endochondral bone formation. Hum Mol Genet 2013;22(15):3048-62.


4. Alexion Pharma International. Compositions comprising natriuretic peptides and methods of use thereof. Patent US 20120164142 A1. Jun, 28th 2012. Free access.


5. Krejci P et al. Interaction of fibroblast growth factor and C-natriuretic peptide signaling in regulation of chondrocyte proliferation and extracellular matrix homeostasis. J Cell Sci 2006; 118: 5089-00. Free access.
 

6. Jones TD et al. The development of a modified human IFN-alpha2b linked to the Fc portion of human IgG1 as a novel potential therapeutic for the treatment of hepatitis C virus infection. J Interferon Cytokine Res 2004;24(9):560-72.

7. Farnum CE et
al. In vivo delivery of fluoresceinated dextrans to the murine growth plate: imaging of three vascular routes by multiphoton microscopy. Anat Rec A Discov Mol Cell Evol Biol 2006;288(1):91-103. Free access.


8. Williams RM et al. Solute transport in growth plate cartilage: in vitro and in vivo.
Biophys J 2007;93(3):1039-50. 
Free access.

9. Aviezer D et al. Fibroblast growth factor receptor-3 as a therapeutic target for Achondroplasia--genetic short limbed dwarfism. Curr Drug Targets 2003;4(5):353-65.


10. Wirth T et al. The blood supply of the growth plate and the epiphysis: a comparative scanning electron microscopy and histological experimental study in growing sheep. Calcif Tissue Int 2002;70(4):312-9.

11. Garcia S et al. Postnatal soluble FGFR3 therapy rescues achondroplasia symptoms and restores bone growth in mice. Sci Transl Med 2013;5:203ra124.