terça-feira, 28 de maio de 2013

Exploring the use of aptamers to treat achondroplasia

Introduction

For a long time we know that there are a multitude of proteins (molecule chains made of amino acids) which are capable to connect directly with distinct regions of the DNA (molecule chains made of nucleotides), either to stimulate the start of a gene reading process (transcription) or to block it. So, it should be readily conceivable that molecules made of nucleotides could also be capable to connect directly with proteins.

In the nineties, with this concept in mind, scientists started to identify a large number of molecules made of DNA or RNA nucleotide sequences, which they ended to name aptamers (1,2). I don’t know if you have already read the last article of this blog. There, I tried to compare the way researchers find new drugs with some kind of fishing or filtering technique. For aptamers, we can use the same concept, since the current technology used to identify them, known by the acronym SELEX, also uses a filtering method to select the best candidate molecules.

Like those proteins capable to bind directly and specifically some target nucleotide sequences of the DNA in the cell nucleus, aptamers are also very specific for their own targets. You could select any part of the target as bait for aptamers. In the case of a receptor enzyme such as our familiar fibroblast growth factor receptor type 3 (FGFR3), this bait could be the external part of the enzyme, or a transmembrane segment or the ATP pockets (figure) we have already reviewed about in previous articles.


This special property, to have a single, specific target, makes aptamers a potential strategy for the treatment of diseases or conditions where a protein is not working properly. Can you imagine that? Let’s give an example of an aptamer already in use in the clinic.

An aptamer in action

Macular degeneration is a condition that affects the eyes of aged people and can lead to blindness. One of the mechanisms thought to drive the disorder is an excess of vascular proliferation (creation of an excessive number of new blood vessels in the retina). The production of new vessels is managed by the activation of a receptor in the cell membrane of cells present in the retina called vascular endothelial growth factor receptor (VEGFR), and of course, the molecule which binds it is a VEGF (also called ligand).

There are several therapies available for the treatment of this condition, with variable efficiency, but one is unique: pegaptanib, the first aptamer to reach the pharmacy. Sold as Macugen, pegaptanib is an aptamer specific for VEGF. Its mode of action is simple: binding VEGF, it blocks the ability of this ligand to connect to the receptor (figure). As the receptor cannot be activated, then new vessel production is not stimulated and the condition does not progress in the same pace it would if left untreated.


Since the discovery of the aptamers, many have been developed for therapeutic purposes and several are now being explored in clinical trials, mostly in cancer. Cancer is truly a huge challenge and a lot of effort has been given to find new therapies to beat it. This includes targets such as cell membrane receptors like the epithelial growth factor receptor (EGFR), another enzyme located across the cell membrane in the same way FGFR3 is. EGFR excessive functioning is often found in breast cancer (and in other kinds, too), and today some of the most effective therapies for breast cancer are directed against EGFRs.

Controlling the amount of signals from the antenna

Before we continue our flight over the aptamers, it will be good to understand how the cell manages the many, many active receptors located in the cell membrane. This will be important for us to understand what we could expect about one of the possible ways an aptamer targeting FGFR3 could work.

As I said, there are hundreds of different receptors installed across the cell membrane, all functioning like chemical antennas to help the cell respond to what is going on in the environment. From immune defense to apoptosis, an incredible number of cell interactions have already been described guided by those antennas.

However, these antennas are not permanent. As for any biological process to keep life on balance, there are a number of control systems that regulate the action span of these receptors. When a receptor enzyme such as FGFR3 is activated by a FGF it forms a molecule complex that starts to signal to its specific chemical cascades (reviewed here), and is attracted to the interior of the cell. 

Then, this complex is spotted by proteins such as ubiquitin, which will tag it and drive it to degradation systems, where the proteins are dismantled. By using these control systems, the cell is able to regulate for how long a receptor can conduct signals from abroad to the cell nucleus. Do you see where we are going?

Aptamers designed to bind EGFR2 (HERB2) causes its accelerated degradation and reduce cancer growth.

In a recent study, researchers have identified a couple of aptamers specific for EGFR2. EGFR2 is one of the four receptor enzymes of the EGFR family and is an important driver of some forms of breast and other cancers. Blocking or disabling EGFR2 causes impairment of tumor growth and reduces the recurring rate in appropriately treated cases. In this study, Mahlknecht G et al. (3) performed several tests with the aptamers they identified and found that they worked by forcing the receptor to degradation without being activated. This, in turn, resulted in inhibition of tumor growth in the models the researchers used. The aptamers tested did not show major concerns in terms of toxicity, which is also important information.

In summary, this study gives evidence that an aptamer having a target located outside the cell is able to block its function and causes the planned effect (here, tumor growth inhibition). The same strategy could be applied for FGFRs.

A strategy using aptamers for achondroplasia could have advantages:
  • Aptamers are small molecules, probably free to transit in the growth plate and reach the chondrocyte;
  • Aptamers are very specific, making low the risk of having off-target effects (when a drug causes effects due to interactions with a non-intended target);
  • Aptamers use to have a low toxicity risk profile.
Nevertheless, aptamers are somewhat fragile and natural victims of the body enzymatic system. They need protection to reach their targets. This can be achieved by cloaking them with one of the several transport and delivery systems already available (we reviewed this here). This is nothing that cannot be overcome.

Concluding

In the end of 2012, in a conversation with an expert in drug development and venture capital investment, I mentioned the aptamers as a strategy to be explored as potential therapy for achondroplasia, but this expert was skeptical about them. My opinion is that we don’t know. Since I learned about aptamers I have been making random searches in medical databases such as Pubmed and never found a study testing an aptamer against FGFR3. Thus, here, the challenge is again to find an investigator with open mind, and with appropriate resources, to explore the possibility of aptamers being used to treat achondroplasia.

References

1. Tuerk C, Gold L. Systematic evolution of ligands by exponential enrichment: RNA ligands to bacteriophage T4 DNA polymerase. Science 1990; 249 (4968): 505-10.

2. Ellington AD, Szostak JW. In vitro selection of RNA molecules that bind specific ligands. Nature 1990; 346(6287):818–22.

3. Mahlknecht G et al. Aptamer to ErbB-2/HER2 enhances degradation of the target and inhibits tumorigenic growth. PNAS 2013; 110 (20): 8170-8175.

domingo, 26 de maio de 2013

Investigadores identifican una nueva clase de inhibidores de FGFRs


Traducción: Maria Cristina Terceros

Pescando nuevas drogas

Actualmente, una de las estrategias más utilizadas para descubrir nuevas potenciales drogas es una denominada high throughput screening (o cribado o selección de alta capacidad en traducción libre; HTS; enlace en inglés). Ésta es una técnica a través de la cual el investigador es capaz de probar millares de compuestos durante un corto periodo de tiempo, permitiendo encontrar aquéllos que tienen mejor / mayor afinidad con un objetivo específico. En otras palabras, los investigadores pescan nuevas potenciales drogas atrayéndolas usando cebos o carnadas específicas (por ejemplo, puede ser el receptor del factor de crecimiento de fibroblastos tipo 3, FGFR3). Otra manera de entender esta técnica es pensar que se trata de una especie de filtro. Se coloca el café en polvo en el filtro, se añade agua caliente y la taza será llenada apenas con un líquido oscuro, rico y sabroso.

Muchas de las drogas anti-cáncer actualmente disponibles de la nueva generación fueron descubiertas usando HTS y los investigadores continúan usando esa técnica para descubrir más. Es de esa manera que la nueva y potencial droga que da el título a este artículo fue identificada. Vamos a analizar brevemente cómo esa droga podría dirigirse hacia una nueva estrategia contra el FGFR3 mutante y ver si ella podría ser usada en la acondroplasia.

Los inhibidores de la tirosina quinasa (TKI) y cómo ellos funcionan

Actualmente, muchos de los nuevos TKI utilizados en el tratamiento del cáncer, tales como imatinib y el dovitinib (también conocido como TKI-258, un pa-inhibidor de FGFR), funcionan a través del bloqueo de una región específica dentro del dominio de la tirosina quinasa de la enzima receptora-objetivo (diana) denominada ATP pocket o, literalmente, bolsillo de ATP.

Vamos a traducir esta frase bastante llena de jerga en algo comprensible. El artículo anterior del blog describe el modo de actuar de los TKI (y incluye un enlace con una animación que muestra cómo es que funciona el TKI), pero, en resumen, estos compuestos inhibidores son como la capa del enchufe eléctrico (figura).


Cuando uno de esos agentes se une al bolsillo del ATP, impide la carga eléctrica de la tirosina (un aminoácido, una parte de la estructura de la enzima), lo que a su vez impide la unión y la activación (el encendido) de las enzimas vecinas. Esto es lo que llamamos de vía o cascada enzimática, donde una enzima activada, activa la siguiente y así en adelante, como si se tratase de un efecto dominó (el cual analizamos aquí). Cuando nosotros tapamos el enchufe, nadie puede encender una licuadora. ¿No es verdad?

Las células cancerígenas utilizan enzimas tales como el FGFR3 para estimular el núcleo de la célula a seguir multiplicándose. Estas enzimas desencadenan cascadas que aceleran la duplicación celular (proliferación) y retrasan el proceso de muerte natural de las células (apoptosis). Entonces, es por este motivo que hay tanta inversión en esta área. Si bloqueamos los estimuladores, el cáncer pierde la capacidad de progresar y puede ser más fácilmente (si es que podemos decirlo así) combatido.

También mencionamos anteriormente en otros artículos del blog que las proteínas (enzimas) pueden tener varias acciones diferentes, dependiendo de su secuencia de aminoácidos y de su configuración estructural. Regiones tales como los bolsillos de ATP son consideradas lugares activos naturales de la enzima. Drogas que actúan en estos lugares activos son descritos como teniendo un modo ortostérico de acción (del griego = lugar correcto, traducción libre). Sin embargo, no todas las drogas reaccionan directamente a través de esta forma ortostérica de acción. Ellas también pueden interferir en la actividad de la enzima en otros lugares a lo largo de su estructura. Cuando eso sucede, los investigadores clasifican esas drogas como poseedoras de un modo alostérico de acción (del griego = otro lugar, traducción libre. Este enlace en inglés que nos conduce a la Wikipedia nos da una explicación interesante sobre este tema). En este contexto, como mencionado anteriormente, los TKIs clásicos funcionan bloqueando  los bolsillos de ATP, lugares activos naturales de las enzimas receptoras, de manera que tienen un modo de acción ortostérico.

Debemos recordar que los FGFRs están divididos en tres partes, también llamadas dominios:
  • Extracelular;
  • Transmembrana;
  • Intracelular o tirosina quinasa

Parte del receptor de la enzima se localiza en el exterior de la célula, funcionando como una antena química. Existe una parte transmembrana, la cual atraviesa la pared celular y es el local donde, en el FGFR3, está localizada la mutación que causa la acondroplasia (figura).


Y, finalmente, está el dominio intracelular, donde los bolsillos de ATP están localizados, la parte responsable por el encendido de la cascada química que muchas veces mencionamos en los artículos de este blog. De esta manera, para que un TKI clásico ejerza su acción, tiene que entrar en la célula.

Sorpresas

Recientemente, Bono F et al, C y Herbert et al. (1,2) publicaron un par de estudios donde buscaban candidatos para potenciales nuevas drogas para bloquear los receptores de tirosina quinase (RTK). Sorprendentemente, durante los análisis, ellos descubrieron que una de las moléculas, aunque no tuviese una afinidad especial con el receptor (la carnada, el cebo recuerden, ellos estaban pescando), fue capaz de reducir la actividad del receptor. Aun testeando, probando este compuesto, al cual ellos le dieron el nombre de SSR128129E, descubrieron que funciona por medio de una interacción con el receptor fuera de la célula, de forma alostérica. Estos dos padrones: trabajar fuera de la célula y un modo alostérico de acción hacen de este nuevo compuesto el primer representante de una nueva clase de inhibidores de enzimas receptoras, tal y como fue interpretado en una nota editorial de la revista Cancer Discovery. (3)

En el caso de la SSR128129E, una de sus características es que ella no bloquea la actividad del FGFR por completo, apenas la reduce, lo que ya es una propiedad bastante interesante. Debemos recordar que tanto el exceso como la carencia de actividad de una proteína pueden causar problemas para un adecuado funcionamiento de una célula. En el caso del FGFR3, la superactividad lleva al comprometimiento del crecimiento del hueso (como lo vemos en la acondroplasia) y la ausencia del FGFR3 puede también traer problemas de salud en modelos animales y en seres humanos. (4,5) Si pudiésemos reducir significativamente la acción del FGFR3 hiperactivo, esto podría ser suficiente para rescatar el crecimiento normal o casi normal del hueso.

El segundo resultado positivo es sobre la localización de la acción. Una vez funcionando fuera de la célula, no tendría que atravesar la membrana celular, una de las barreras naturales para cualquier droga con un objetivo intracelular.

La tercera propiedad positiva es que ella parece ser bastante específica para FGFRs, no reaccionando con los demás receptores de la pared celular. Esto es muy, pero muy importante, ya que uno de los más grandes desafíos de los TKI clásicos es que ellos no son lo suficientemente específicos contra los FGFR (o particularmente FGFR3), para permitir su uso en la acondroplasia (como en el caso del TKI-258) y otros muchos inhibidores de FGFR disponibles ya revisados en artículos anteriores del blog.

Una cuarta información positiva es que, tradicionalmente, los inhibidores (o moduladores alostéricos, otra forma de nombrarlos) tienden a producir menos toxicidad que los fármacos ortostéricos clásicos.

Directo al punto: se trata de una opción para la acondroplasia?

Los investigadores estaban buscando nuevos inhibidores de FGFRs y la molécula que descubrieron es un inhibidor pan-FGFR. Esto significa que debido a la fuerte homología entre los receptores (que son muy similares en estructura), el fármaco funciona contra todos los cuatro FGFR conocidos. A partir de un primer análisis no sería apropiado para uso en cuerpos en crecimiento, ya que éstos, naturalmente, dependen de un adecuado funcionamiento de estos receptores químicos. Sin embargo, antes de decir que no a ciegas, este podría ser el caso para poner a prueba en un modelo de cultivo celular de la acondroplasia. Los investigadores probaran el SSR128129E en varios modelos de cáncer y la respuesta fue positiva. Ya sea que este compuesto particular no se puede utilizar en la acondroplasia, el descubrimiento de esta nueva clase de fármacos se abre una puerta para explorar moléculas específicas, lo cual es una perspectiva interesante.

Resumen

Fue descrita el primero compuesto de una nueva clase de inhibidores de FGFR:
Trabaja fuera de la célula en las cuatro FGFR, de forma alostérica;
No bloquea completamente la actividad de FGFR;
Funciona en las células cancerosas que presentan sobreexpresión o la hiperactividad de FGFR.

Novedad

Hace unos días, en otro estudio se trata de una estrategia que hemos discutido aquí probado con éxito en contra de su uso otro receptor enzima. Vamos a explorar este estudio en el próximo artículo, teniendo en cuenta las posibles correlaciones con acondroplasia y FGFR3.

Referencias

1. Bono F et al. Inhibition of tumor angiogenesis and growth by a small-molecule multi-FGF Receptor blocker with allosteric properties. Cancer Cell 2013;23:477–88.

2. Herbert C et al. Molecular mechanism of SSR128129E, an extracellularly acting, small-molecule, allosteric inhibitor of FGF receptor signaling. Cancer Cell 2013;23:489-501.

3. Research Watch: Targeted therapy. A first-in-class FGFR Inhibitor suppresses tumor growth Cancer Discovery. Published online first April 25, 2013; doi:10.1158/2159-8290.CD-RW2013-088.

4. Colvin JS et al. Skeletal overgrowth and deafness in mice lacking fibroblast growth factor receptor 3. Nature Genetics 1996;12:390-7. doi:10.1038/ng0496-390.

5. Toydemir RM et al. A novel mutation in FGFR3 causes camptodactyly, tall stature, and hearing loss (CATSHL) syndrome. Am J Human Genet 2006;79(5):935–41.

sábado, 11 de maio de 2013

Pesquisadores identificam uma nova classe de inibidores de FGFRs


Pescando novas drogas

Atualmente, uma das estratégias mais utilizadas para descobrir novas potenciais drogas é um chamado de high throughput screening (ou triagem de alta capacidade em tradução livre; HTS; link em inglês). Esta é uma técnica pela qual o investigador é capaz de testar milhares de compostos num curto período de tempo, permitindo encontrar aqueles que têm melhor / mais afinidade com um alvo específico. Em outras palavras, os pesquisadores pescam novas potenciais drogas atraindo-as usando iscas específicas (por exemplo, pode ser o receptor de fator de crescimento de fibroblastos tipo 3, FGFR3). Outra maneira de entender esta técnica é pensar que é uma espécie de filtro. Você coloca o café em pó no filtro, adiciona água quente e sua xícara será preenchida apenas com o líquido escuro, rico e saboroso.

Muitas da nova geração de drogas anticâncer disponíveis hoje foram descobertas usando HTS e os pesquisadores continuar a usar essa técnica para descobrir mais. É assim que a nova droga potencial do título deste artigo foi identificada. Vamos analisar brevemente como essa droga poderia apontar para uma nova estratégia contra o FGFR3 mutante e ver se ela poderia ser usada na acondroplasia.

Os inibidores da tirosina quinase (TKI) e como eles funcionam

Atualmente, muitos dos novos TKI utilizados no tratamento do câncer, tais como o imatinib e o dovitinib (também conhecido como TKI-258, um pan-inibidor de FGFR), funcionam pelo bloqueio de uma região específica dentro do domínio da tirosina quinase da enzima receptora-alvo chamada de ATP pocket ou, literalmente, bolso de ATP.
Vamos traduzir esta frase cheia de jargão em algo compreensível. Este artigo anterior do blog descreve o modo de ação dos TKI (e inclui um link para uma animação que mostra como o funciona o TKI), mas, em resumo, estes compostos inibidores são como uma capa de tomada elétrica (figura).

 

Quando um agente desses se liga ao bolso de ATP, impede o carregamento elétrico da tirosina (um aminoácido, uma parte da estrutura da enzima), o que por sua vez impede a ligação e a ativação de enzimas vizinhas. Isso é o que chamamos de via ou cascata enzimática, onde uma enzima ativada ativa a próxima e assim por diante, como em um efeito dominó (que analisamos aqui). Quando você cobre a tomada ninguém pode ligar um liquidificador ou uma cafeteira, pode?

As células cancerosas utilizam enzimas como o FGFR3 para estimular o núcleo da célula para continuar a multiplicar-se. Estas enzimas desencadeiam cascatas que aceleram duplicação celular (proliferação) e retardam o processo de morte natural das células (apoptose). Então, é por isso que há tanto investimento nesta área. Se você bloquear os estimuladores, o câncer perde a capacidade de progredir e pode ser mais facilmente (se pudermos falar assim) combatido.

Também mencionamos anteriormente em outros artigos do blog  que as proteínas (enzimas) podem ter várias ações distintas, dependendo da sua sequência de aminoácidos e da sua conformação estrutural. Regiões como os bolsos de ATP são considerados sítios ativos naturais da enzima. Drogas que atuam nesses sítios ativos são descritas como tendo um modo ortostérico de ação (do grego, que significa lugar certo, em tradução livre). No entanto, nem todas as drogas agem diretamente por esta forma ortostérica de ação. Elas também podem interferir na atividade da enzima em outros locais ao longo da sua estrutura. Quando isso ocorre, os pesquisadores classificam essas drogas como tendo um modo alostérico de ação (do grego, que significa outro lugar, em tradução livre; este link em inglês para a Wikipedia dá uma explicação interessante sobre este tema). Neste contexto, como mencionado acima, TKIs clássicos funcionam bloqueando os bolsos de ATP, sítios ativos naturais das enzimas receptoras, de modo que têm um modo de ação ortostérico.

Você deve se lembrar de que os FGFRs são dividos em três partes, também chamados de domínios:
  • extracelular;
  • transmembrana;
  • intracelular (ou tirosina quinase)
Parte do receptor da enzima localiza-se no exterior da célula, funcionando como uma antena química. Há uma parte transmembrana, que atravessa a parede celular e é o lugar onde, no FGFR3, a mutação que causa a acondroplasia está localizada (figura).


E, finalmente, há o domínio intracelular, onde os bolsos de ATP estão localizados, a parte responsável por ligar a cascata química que muitas vezes mencionamos nos artigos deste blog. Assim, para um TKI clássico exercer a sua ação, tem de entrar na célula.

Surpresas

Recentemente, Bono F et al. C e Herbert et al. (1,2) publicaram um par de estudos em que eles procuravam candidatos para potenciais novas drogas para bloquear  receptores de tirosina quinase (RTK). Surpreendentemente, durante as análises, eles descobriram que uma das moléculas, embora não tivesse uma afinidade especial para o receptor (a isca, lembre,eles estavam pescando), foi capaz de reduzir a atividade do receptor.
Ainda testando este composto, que eles chamaram de SSR128129E, eles descobriram que ele funciona através da interação com o receptor fora da célula, de forma alostérica. Estes dois padrões: trabalhar fora da célula e um modo alostérico de ação fazem deste novo composto o primeiro representante de uma nova classe de inibidores de enzimas receptoras, tal como interpretado em uma nota editorial da revista Cancer Discovery. (3)

No caso da SSR128129E, uma de suas características é que ela não bloqueia a atividade do FGFR completamente, apenas a reduz, o que é uma propriedade muito interessante. Devemos lembrar que tanto o excesso de atividade quanto zero atividade de uma proteína podem causar problemas para o adequado funcionamento de uma célula. No caso do FGFR3, a superatividade conduz ao comprometimento do crescimento do osso (como visto na acondroplasia) e a ausência de FGFR3 pode também trazer problemas de saúde em modelos animais e em seres humanos. (4,5) Se pudéssemos reduzir significativamente a ação do FGFR3 hiperativo, isso poderia ser suficiente para resgatar o crescimento normal ou quase normal do osso.

O segundo resultado positivo é sobre seu local de ação. Uma vez que funciona fora da célula, ele não teria de atravessar a membrana celular, uma das barreiras naturais para qualquer droga com alvo intracelular.

A terceira propriedade positiva é que ela parece ser muito específica para FGFRs, não reagindo com os outros receptores da parede celular. Isto é muito, muito importante, uma vez que um dos maiores desafios dos TKI clássicos é que eles não são suficientemente específicos contra os FGFR (ou particularmente FGFR3), para permitir a sua utilização na acondroplasia (como no caso do TKI-258 e vários outros inibidores de FGFR disponíveis já revistos nos artigos anteriores do blog).

Uma quarta informação positiva é que, tradicionalmente, os inibidores (ou moduladores alostéricos, outra forma de nomeá-los) tendem a produzir menos toxicidade do que os fármacos ortostéricos clássicos.

Direto ao ponto: essa é uma opção para acondroplasia?

Os investigadores estavam à procura de novos inibidores de FGFRs e a molécula que eles descobriram é um pan-inibidor de FGFR. Isso significa que, devido à forte homologia entre os receptores (eles são bastante semelhantes em termos de estrutura), a droga funciona contra todos os quatro FGFRs conhecidos. A partir de uma primeira análise, não seria adequado para a utilização em corpos em crescimento, visto que esses, naturalmente, dependem de um adequado funcionamento químico destes receptores. No entanto, antes de dizer não às cegas, este poderia ser o caso de testá-lo em um modelo de cultura celular da acondroplasia. Os investigadores do SSR128129E testaram em vários modelos de câncer e a resposta foi positiva. Não importa se este composto em particular não possa ser utilizado na acondroplasia, a descoberta desta nova classe de drogas abre uma porta para explorar moléculas mais específicas, o que é uma interessante perspectiva.

Resumo

Foi descrito o primeiro composto de uma nova classe de inibidores de FGFR:
  • funciona fora da célula em todas as quatro FGFR, de uma forma alostérica;
  • não bloqueia completamente a atividade dos FGFRs
  • ele funciona em células de câncer que apresentam superexpressão ou superatividade de FGFRs.

Novidade

Dias atrás, outro estudo lidando com uma estratégia que já discutimos aqui testou, com sucesso, seu uso contra outra enzima receptora. Vamos explorar este estudo no próximo artigo, tendo sempre em mente possíveis correlações com o FGFR3 e a acondroplasia.

Referências

1. Bono F et al. Inhibition of tumor angiogenesis and growth by a small-molecule multi-FGF Receptor blocker with allosteric properties. Cancer Cell 2013;23:477–88.

2. Herbert C et al. Molecular mechanism of SSR128129E, an extracellularly acting, small-molecule, allosteric inhibitor of FGF receptor signaling. Cancer Cell 2013;23:489-501.

3. Research Watch: Targeted therapy. A first-in-class FGFR Inhibitor suppresses tumor growth Cancer Discovery. Published online first April 25, 2013; doi:10.1158/2159-8290.CD-RW2013-088.

4. Colvin JS et al. Skeletal overgrowth and deafness in mice lacking fibroblast growth factor receptor 3. Nature Genetics 1996;12:390-7. doi:10.1038/ng0496-390.

5. Toydemir RM et al. A novel mutation in FGFR3 causes camptodactyly, tall stature, and hearing loss (CATSHL) syndrome. Am J Human Genet 2006;79(5):935–41.

quinta-feira, 9 de maio de 2013

Researchers discover a new class of FGFR inhibitors

Fishing new drugs

Currently, one of the most used strategies to discover new potential drugs is one called high throughput screening (HTS). This is a technique by which the researcher is able to test thousands of compounds in a very short timeframe, allowing finding those which have best/more affinity with a specific target. In other words, researchers are fishing new potential drugs attracting them by using specific baits (could be for instance the fibroblast growth factor receptor type 3, FGFR3). Another way to see this practice is to think it is a kind of filter. You put the grounded coffee in the filter, add hot water and your cup will be filled only with the rich and tasty dark liquid.

Many of the new generation of anticancer drugs available today were discovered using HTS and the researchers keep using this technique to find more. That’s how the new potential drug of the title of this article has been identified. We will be briefly reviewing how can this new drug could point to a new strategy against the mutated FGFR3 and see if it could be used in achondroplasia.

The tyrosine kinase inhibitors (TKI) and how they work

Currently, many of the new TKIs used in the treatment of cancer, such as imatinib, dovitinib (also known as TKI-258, a pan-FGFR inhibitor), work by blocking a specific region within the tyrosine kinase domain of the target receptor enzyme called ATP pocket.

Let’s translate this hard jargon sentence in something meaningful. This previous article of the blog describes the TKI mode of action (it includes a link to an animation showing how the TKIs work) but, in short, these inhibitor compounds are like an electric outlet cover (figure).

When one such agent binds to the ATP pocket, it prevents the electrical charging of the tyrosine (an amino acid, part of the structure of the enzyme), which in turn prevents the binding and activation of neighbor enzymes. This is what we call enzymatic cascade or pathway, where an activated enzyme activates the next one and so on, like in a domino chain (we reviewed this here). When you cover the outlet nobody can plug in a blender or a coffee maker, could they?

Cancer cells use enzymes like FGFR3 to stimulate the cell nucleus to keep multiplying. These enzymes trigger cascades that accelerate cell duplication (proliferation) and slow the cell natural death process (apoptosis). So, you see why there is so much investment in this area. If you block the stimulators, the cancer loses the ability to progress and can be more easily (if so) combated.

We have also previously mentioned that proteins (enzymes) may have several distinct actions depending on their amino acid sequence and structural conformation. Regions such as the ATP pockets are considered natural active sites within the enzyme. Drugs that act on these active sites are described has having an orthosteric mode of action (from the Greek, meaning right place, in free interpretation). However, not all drugs act directly by this orthosteric way of working. They can also interfere in the enzyme activity in other places along its structure. When this occurs, researchers classify these drugs as having an allosteric mode of action (from the Greek, meaning other place, in free interpretation; this link to Wikipedia gives a nice explanation about this topic). In this context, as mentioned above, classical TKIs work blocking the ATP pockets, natural active sites of receptor enzymes, so they have an orthosteric mode of action.

You might remember that FGFRs have three regions, also called domains:

  • extracellular;
  • transmembrane;
  • intracellular (or tyrosine kinase)

Part of the receptor enzyme is located outside the cell, working like a chemical antenna. There is a transmembrane part, which crosses the cell wall and is the place where, in the FGFR3, the achondroplasia mutation is located (figure).


And, finally, there is the intracellular domain, where the ATP pockets are located, the part responsible for turning on the chemical cascade we are often mentioning in the articles of this blog. Thus, for a TKI to exert its actions, it must enter the cell.

Surprises

Recently, Bono F et al. and Herbert C et al. (1,2) published a pair of studies in which they were looking for candidates for new potential drugs to block receptor tyrosine kinases (RTKs). Surprisingly, during their analyses they found that one of the molecules, although not having a special affinity to the receptor (the bait, remember, they were fishing), was capable to reduce the receptor activity.

Testing this compound further, which they called SSR128129E, they discovered that it works by interacting with the receptor outside the cell, in an allosteric fashion. This two patterns: working outside the cell and allosteric mode of action make this new compound a first representative of a new class of receptor enzyme inhibitors, as interpreted in an editorial note of the journal Cancer Discovery. (3)

In the case of SSR128129E, one of its characteristics is that it does not block FGFR activity completely, just reduce it, which is a very interesting property. We must remember that both over activity and zero activity of a protein might cause problems to the appropriate functioning of a cell. In the case of FGFR3, over activity leads to bone growth impairment (as seen in achondroplasia) and no FGFR3 might also bring health problems in animal models and in humans. (4,5) If we could reduce significantly the action of an overactive FGFR3, this could be sufficient to rescue normal or near normal bone growth.

The second positive finding is about its site of action. Since it works outside the cell, it wouldn’t have to cross the cell membrane, one of the natural barriers for any intracellular acting drug.

The third positive property is that it seems to be very specific for FGFRs, not reacting to the other cell wall receptors. This is very, very important, since one of the challenges of the classical TKIs is that they are not specific enough against FGFRs (or particularly FGFR3) to allow their use in achondroplasia (the case of TKI-258 and other several FGFR inhibitors we have already listed in previous articles of the blog).

A fourth positive insight is that, traditionally, allosteric inhibitors (or modulators, another way to name them) tend to produce less toxicity than the classical orthosteric drugs.

Straight to the point: is this an option for achondroplasia?

The researchers were looking for new inhibitors of FGFRs and the molecule they found is a pan-FGFR inhibitor. This means that it works against all four recognized FGFRs due to their strong homology (they are quite similar in terms of structure). From a first sight, it would not be suitable for use in growing organisms, as they naturally rely on proper chemical functioning of these receptors. However, before just blindly saying no, this could be the case of testing it in an achondroplasia-like cell culture model. The investigators tested SSR128129E in several cancer models and the response was positive. No matter if this particular compound couldn’t be used in achondroplasia, the discovery of this new drug class opens a door to explore more specific molecules, which is an interesting perspective.

Summary
  • the first compound of a new class of FGFR inhibitors has been described;
  • it works in all four FGFRs outside the cell, in an allosteric fashion;
  • it doesn’t block completely FGFR activity
  • it works in cancer cells bearing over expression or over activity of FGFRs.
News

Days ago another study dealing with a strategy wich we have already discussed here was tested successfully against another receptor enzyme. We will explore this study in the next article, always having in mind potential correlations with FGFR3 and achondroplasia.

References

1. Bono F et al. Inhibition of tumor angiogenesis and growth by a small-molecule multi-FGF Receptor blocker with allosteric properties. Cancer Cell 2013;23:477–88.

2. Herbert C et al. Molecular mechanism of SSR128129E, an extracellularly acting, small-molecule, allosteric inhibitor of FGF receptor signaling. Cancer Cell 2013;23:489-501.

3. Research Watch: Targeted therapy. A first-in-class FGFR Inhibitor suppresses tumor growth Cancer Discovery. Published online first April 25, 2013; doi:10.1158/2159-8290.CD-RW2013-088.

4. Colvin JS et al. Skeletal overgrowth and deafness in mice lacking fibroblast growth factor receptor 3. Nature Genetics 1996;12:390-7. doi:10.1038/ng0496-390.

5. Toydemir RM et al. A novel mutation in FGFR3 causes camptodactyly, tall stature, and hearing loss (CATSHL) syndrome. Am J Human Genet 2006;79(5):935–41.

domingo, 5 de maio de 2013

Nuevas evidencias del mecanismo de acción del CNP en la via del FGFR3


Traducción de la versión en Portugues para el Español: Google Translator, con revisón del Autor

El FGFR3 y el CNP en la placa de crecimiento del cartílago

En los últimos dos años, la gente de todo el mundo interesada ​​en la búsqueda de terapias alternativas para las condrodisplasias relacionadas con mutaciones del receptor de factor de crecimiento de fibroblastos tipo 3 (FGFR3) y, especialmente para la acondroplasia, han prestado atención al análogo del péptido natriurético de tipo C (CNP) BMN -111, que se encuentra actualmente en desarrollo clínico como terapia potencial para la acondroplasia.
  
El FGFR3 se ha descrito como capaz de reducir la capacidad de los condrocitos para proliferar y madurar a un llamado estado de hipertrofia (1,2; también revisado aquí). El FGFR3 actúa a través de la activación de una serie de reacciones químicas controladas dentro de la célula, generalmente llamadas cascadas o vías (figura).


El CNP actúa inhibiendo una de las cascadas químicas más importantes desencadenadas por la activación del FGFR3, a través de la Ras-Raf-MEK-ERK (1.2, también revisado aquí). Estos acrónimos identifican un grupo de proteínas con propiedades químicas activas y por lo tanto  llamadas enzimas (la ruta de las enzimas mitogen activated protein kinase o MAPK).

  La cascada MAPK, cuando se activa el FGFR3 en los condrocitos, las principales células de la placa de crecimiento del cartílago, actúa como un freno en el proceso de crecimiento de los huesos y, por tanto el FGFR3 es un controlador negativo natural del crecimiento del hueso. Cuando el FGFR3 es hiperactivo, los condrocitos no pueden proliferar y madurar normalmente y se crea menos hueso, lo que resulta en huesos más cortos, especialmente los apendiculares (brazos y piernas). Ahora, usted tiene una idea de cómo una mutación activadora del FGFR3 conduce a una deficiencia de crecimiento óseo como se ve en la acondroplasia. Sin embargo, vamos a ver con más detalle cómo las cascadas de FGFR3 y CNP interactúan dentro de los condrocitos.
  
Cuando el CNP se une a su receptor, llamado NPR-B, en la membrana celular de los condrocitos, desencadena una cascada química que bloquea la cascada MAPK en el nivel de la enzima Raf (figura). En este caso, como enzimas las MAPK tienen la actividad reducida, los otros mecanismos que controlan el crecimiento de hueso son, al menos en parte, restaurados y los condrocitos de nuevo son libres para multiplicar y madurar, y el crecimiento óseo es rescatado. Esto es cierto en ratas y, presumiblemente, en otros modelos animales que han sido expuestos a el BMN-111. Actualmente no hay ningún artículo que describe el efecto de la administración de CNP en animales más grandes, pero se sabe que, durante una presentación pública en el que se anunció el programa de BMN-111, el desarollador de este análogo del CNP reveló que los monos expuestos a el crecieron más de lo esperado.


El mecanismo de crecimiento de los huesos es complejo

El crecimiento del hueso es un proceso complejo, donde los condrocitos en la placa de crecimiento del cartílago entran en un programa de cambios muy rápidos y dinámicos determinados por las reacciones causadas por moléculas locales o sistémicas (en su mayoría proteínas o péptidos). Al leer local, significa que la proteína o el agente es producido por las células de la placa de crecimiento o en las proximidades (por ejemplo el FGFR3, CNP, PTHrP, vea los artículos anteriores del blog para más detalles). Sistémico significa que el agente se produce lejos de la placa de crecimiento, como las hormonas de la paratiroide y pituitaria.

Un estudio muestra los efectos de CNP en el crecimiento del hueso desde otro punto de vista

 Un reciente estudio de Ono y asociados (3) y publicado en Human Molecular Genetics, añade aún más complejidad a este proceso. Los autores describen la función de la proteína llamada neurofibromina, una proteína común presente en muchas células, los condrocitos. Su papel en los condrocitos no se entiende totalmente, como tambíen su importancia para el buen desarrollo de la placa de crecimiento. Los autores testaran un gran número de posibles conexiones que esta proteína podría tener con algunos de los otros agentes locales de crecimiento, incluyendo el FGFR3, CNP, IHH y PTHrP.

Lo relevante en este estudio, cuando se piensa en la acondroplasia?

 Ellos encontraron que la neurofibromina ejerce su función reguladora en el desarrollo endocondral (eso es como los científicos citan el proceso por el cual los huesos largos crecen a través del desarrollo de la placa de crecimiento del cartílago, el endochondral development), que actúa como un inhibidor de la cascada MAPK activada por el FGFR3. La neurofibromina tiene algunas propiedades similares a otras enzimas llamadas GTPasas (el asa és un sufijo que describe una enzima) que, naturalmente, reducen la actividad de la enzima Ras, la primera enzima activada por FGFR3 en la cascada de MAPK. En este estudio, los investigadores demostraron que la acción de la neurofibromina es similar al efecto de CNP en la cascada MAPK (revisado aquí). Cuando testaran células sin la neurofibromin, condrocitos redujeron su capacidad de proliferación y maduración y los huesos crecieron menos, similar a lo que ocurre en los casos de mutaciones hiperactivas del FGFR3 . Cuando inyectaron CNP en animales que carecian de la neurofibromina, el crecimiento del hueso fue rescatado.

Por otra parte, observaron que los condrocitos mutantes (sin neurofibromina) también produjeron menos IHH, otro factor crítico para el crecimiento de cartílago y hueso, y que a su vez también es importante para la generación de la PTHrP. Sabemos que IHH y PTHrP son muy importantes para el buen desarrollo de la placa de crecimiento (4, también analizado en este artículo en el blog).

Uno podría pensar que la sobre-expresión (o exceso) de la neurofibromina podría rescatar el crecimiento de los huesos en la acondroplasia, pero sería muy difícil, ya que la proteína neurofibromina es universal y su desregulación (para más o menos) podría tener efectos indeseables en el individuo tratado. Sin embargo, este estudio aporta más una información valiosa, de como la MAPK actúa en los condrocitos.

En conclusión, este estudio examina y confirma, entre otros resultados relevantes, como el CNP actua en la placa de crecimiento, proporcionando más evidencia para su potencial uso en terapias para la acondroplasia.

Otros análogos de CNP en el horizonte?

Otra información relevante ofrecida en este estudio se relaciona con el tipo de CNP que los investigadores utilizaran para las pruebas. Eligieron un análogo distinto del CNP que llamaron NC-2. El NC-2 tiene una larga vida media en comparación con el CNP natural (~ 20h vs. ~ 3 min) y resulta de la combinación de una parte de la molécula del CNP con la parte básica de un anticuerpo (que llamamos de Fc de la inmunoglobulina G, IgG). Aún así no pudo encontrar más información acerca de este compuesto más allá de lo que se describe en el estudio de Ono y sus colegas, por lo que hay un montón de preguntas sobre el mismo. Pero, al menos, dos puntos son interesantes: con la estructura descrita en su trabajo, parece que el NC-2 es una molécula grande (mucho más grande que el CNP natural). Una vez que se mostró activo en las pruebas, cabe preguntarse si los investigadores observaron efectos tóxicos en animales de laboratorio o cualquier otra evidencia de efectos adversos en la larga exposición a NC-2. Por ejemplo, hay que recordar que el BMN-111, el otro analógo conocido del CNP, tiene una vida media de 20 minutos y provoca efectos leves en la presión arterial (5).

El otro punto es que la molécula llamada FP-1039 (6), que he mencionado en el artículo anterior deste blog, también comprende una porción Fc de IgG, por lo que es una molécula de gran tamaño. Desde que la CN-2 parece alcanzar la placa de crecimiento, sería interesante saber si el FP-1039 alançou también la placa de crecimiento en los experimentos durante las pruebas con este compuesto.

Las puertas se están abriendo.


Referências

1. Horton W. Molecular pathogenesis of achondroplasia. GGH 2006; 22 (4): 49-54
2. Foldynova-Trantirkova S et al. Sixteen years and counting: the current understanding of fibroblast growth factor receptor 3 (FGFR3) signaling in skeletal dysplasias. Hum Mutat 2012; 33:29–41.
3. Ono K et al. The Ras-GTPase activity of neurofibromin restrains ERK-dependent FGFR signaling during endochondral bone formation. Hum Mol Genet 2013; 22(15): 3048–62. doi: 10.1093/hmg/ddt162.
5. Kronemberg H. Developmental regulation of the growth plate. Nature 2003; 423: 332-6Biomarin press release.  
7. Harding TC et al. Blockade of nonhormonal fibroblast growth factors by FP-1039 inhibits growth of multiple types of cancer. Sci Transl Med 2013;5:178ra39.